[問題] Real-time PCR的三重複

[leondemon (狗狗)]

三重複的意義何在？？？
為什麼要做三重複？？？
三重複要怎麼做？？？


最近因為這個問題，跟我很在意的人鬧得有點不愉快
因此想聽聽這邊的前輩的解答。


我說說我的看法。


我覺得三重複的意義，在於要確定每次的做出來的結果是一致的。

應該說，任何實驗，都要確定其「再現性」，才能說這個結果是有意義的。

因此，我有看過講究一點的paper，他們有測試同樣的reaction在不同時間上機，

來確保機器在不同的時候上機，其結果會有差異。


而我覺得三重複的配法，應該是要除了cDNA以外的reagents先混合配好加入各well中，

然後再取三次cDNA，分別加入三個reaction中，證明每次取的cDNA都能做出一致的結果。

因為PCR反應中，cDNA的初始濃度，應該是影響結果差異的最主要原因，

所以針對cDNA做不同的三次加入的三重複，來確定人員沒有操作失誤，

而除了cDNA以外的reagents先mix在一起，是要做到「在相同環境下，測試一個可能變數」


所以如果做出來的擴增曲線是重疊的，那表示三次的操作都沒問題，

若是有一條沒重疊，表示那次的pipetting可能有問題，於是排除該數據；

若是三條都沒重疊，則表示結果不一致（無再現性），因此該組數據都不能用。





上面是我的看法，但是我聽到有人的三重複作法跟我不同。

他們是將所有的試劑混合在一起，這包括了cDNA、primer、和SYBR GREEN master mix，

混合好後，直接分裝到三個well中，然後跑出來的擴增取線很完美的重疊。



可是我卻覺得這樣做已經失去了「三重複」的含意，

只是為了做「三重複」而做的「三重複」。


因為他們從tube裡面只取了一次cDNA到整個mixture中，

這樣的三重複，就不能證明，「下次再做一樣的實驗，擴增曲線會是一樣的情形」

因為他們沒有做「不同次數抽取cDNA時，其擴增曲線是一樣的」

畢竟cDNA的初始濃度稍有不同（可能是pipetting或人員操作技術導致），

其結果可能就會有明顯差異。

我覺得他們那樣的作法，只是把「同一個reaction，在同一台機器上跑三次」

能證明的，頂多只有「這台機器很穩定，因為在不同的well位置，其熱循環結果一致」

可是要證明這個做什麼呢？ 這不是這台機器「基本」應該具備的條件嗎？

對每個reagent只有做一次pipetting，那要如何表示這個反應的「再現性」？




根據我的實驗經驗和speciallist的指導，

要降低cDNA的pipetting error，最好的方式就是先稀釋整個cDNA來源，

充分混合均勻（vortex & spin down）後，再取cDNA加入各reaction中。

這樣可以使原本可能只要加 0.5 ul的cDNA，變成加入 5 ul（因為cDNA稀釋10倍），

這樣pipetting時，一些的些微誤差，會因為取的體積變大而降低變異係數（差異百分比）




我想聽聽看各位前輩對這兩種三重複作法，有什麼樣的見解？

哪一種方法是正確的？ 還是兩種都正確？

謝謝～

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 59.120.7.114
推 aggaci:都沒錯...但你的方法較麻煩，誤差大很正常，你同學是正確的
→ aggaci:sorry 糾正一下...你同學的方法較好
推 leondemon:比較好的原因，是因為data比較好看嗎?
→ leondemon:我沒有要戰的意思，但是我不懂那樣做三重複的意義何在?
推 aggaci:因為我覺得兩種方法對於DATA的呈現ㄧ樣
→ aggaci:都只是代表3重複的其中ㄧ次，你的"三重複"我稱之"三平行"
推 chvkimo:我是覺得你的想法應該比較嚴謹  因為如果這實驗要別人來操
→ chvkimo:做的話 應該都是不同時間點做出來的(因為再現性) 我有時候
→ chvkimo:念PAPER 也看過你同學的那種作法 可是我是覺得 那不是只是
→ chvkimo:拿來作平均用的嗎? 所以我自己是偏向跟你一樣的想法
→ chvkimo:另外  我不是前輩  只是提出我的看法
推 Tierry:個人三重複作法是連mixture都分開做 簡單說是3次獨立的實驗
推 K587262:這就是統計學中  duplication跟replication的基礎了
→ K587262:我贊同你的做法  不從母群體中重新抽取的檢定一點都不科學
→ K587262:不過這種事情沒必要跟人爭  相信自己  但是會辛苦點
推 satasumi:三重複是指三次重新的實驗,而非同一取樣樣品測三次
→ satasumi:如果是只是重測三次,只是測定你的樣品是否均值,
→ satasumi:而非測定其是否準確的再現性,你是對的.你同學的是偷懶的
推 jennywei1125:duplication跟replication差別
推 sisyphus:不同意A的說法..我覺得你是對的,但是你同學會比較早畢業
推 pooldodo:我都會找學弟來，給他看我的筆記然後由他重作
→ pooldodo:如果也可以都做出來我才比較會用
推 mojimoji:三重複指的當然是三次獨立的實驗做出來的數據一樣啊！所
→ mojimoji:以實驗的reagent應該都是當次才加吧！不管什麼實驗都一樣
→ mojimoji:只要是重複就是指獨立分開而得到的結果有一致性 就是成攻
→ mojimoji:的repeat 且data consist 所以DATA才可信
推 nerdz:我同意你的看法..你同學的3重複是要測定不同WELL間的差異..
推 Danielle:你同學的作法沒有意義 那跟三管放在同一個well跑一樣