[求救] 有關蛋白質純化..

[bluecsky (我要藍藍淡淡的天空)]

我使用的是QIAGEN PQE30這各vector

6個his-tag是在n-termial

host是M15這株e.coli

目標的蛋白質大小(加上his-tag以及前端)約為42KD

對過序列..reading frame沒有問題

在使用37度下, 1mM IPTG誘導後

在大約4x的位置有看到一個明顯的band

之後使用QIAGEN手冊上的方法去鑑定可溶性

確定存在soluble fraction中

接者我使用Ni-NTA agarose去和soluble fraction混合(在native condiction)

再根據手冊上的流程去做wash跟elution..

但是問題來了..

第一個..我在第一段binding remain的地方發現到

我目標的那些protein幾乎都沒有跟Ni-NTA bind

之後也都是空空沒有任何東西了..

這是我的lysis buffer的問題嘛?還是我使用的Ni-NTA有問題?

還是我根本就沒誘導出我的protein?

將lysis buffer中的imidazole減少會改善這種狀況嗎?

還是必須使用denature的condiction呢?

(以前我使用安碼西亞的His trap spin column也是跑出同樣的結果..

目標protein根本沒有bind上去)

另外有另一個問題

我試過使用低溫(16度)加上0.1 mM的IPTG去誘導過

結果出現了兩個band都明顯變粗及顏色變深

其中一個大約在4x KD的位置..另一個約在6X KD的位置

這樣是有可能的嗎?這樣的結果還能拿去做純化嗎?

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                 啊！我們真的是拼圖(喘)
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 220.137.56.252
※ 編輯: bluecsky        來自: 220.137.56.252       (09/16 20:02)
→ runpapa0520:你純化前有用WESTERN確認嗎? 先看到底有沒有表現出
→ bluecsky:沒有抗體怎麼做western...囧
→ bluecsky:還是R大的意思是說抓his-tag的抗體?..有這種東西嗎?
推 runpapa0520:你都接6his了  當然用ANTI-6his去確認看看摟
推 bluecsky:原來如此阿..那去找找有沒有相對應的anti-body..
→ runpapa0520:很多家都有賣，隨便問問都有，GE也有。先確認有再純化
→ bluecsky:了解..不然這樣盲目的搞下去也不知道何時能了..= =
→ bluecsky:不過我的目標protein是一個transmembrane protein..
→ bluecsky:會比較難以誘導或是純化嗎?
推 runpapa0520:膜蛋白不好說ㄟ  看運氣!參考:誘導表現蛋白質 討論串
推 pizzicato:請問你lysis buffer中 imidazole濃度多少？
→ pizzicato:8mM 上下還OK...再多可能會影響 column binding
推 bluecsky:跟據QIAGEN的手冊配的..lysis buffer中有10mM的imidazole