Re: [方法] 如何對plasmid做site-directed mutation ?

[lentivirus ()]

   其實做site direct mutagenesis方法還蠻多種的，

   這個方法還不錯用


            1                3
       (RE1)---->           ---->

        RE1------------------X------------------RE2
                           <----          <----(RE2)
                             2              4


   A:  (RE1------------------X---)
   B:                    (---X-------------------RE2)

   C:  (RE1------------------X-------------------RE2)



   1st PCR: 分別做 primer 1 及 primer 2,  primer 3 及 primer 4

            得product A 及 product B (template source: target plasmid)

            要將product cut and purify

   2st PCR: 分別做 primer 1 及 primer 4

            得 product A、B、C (template source: product of 1st PCR (1:1)

            取product C--->purify, cut by RE1 and RE2

            將target plasmid for SDR, cut RE1 and RE2 (取長段，短段為置換)

            Ligation---transformation--->colony identification by sequencing


   Note：RE1-------RE2的長度當然愈短愈好，一般大概三到五百bp

         RE1及RE2最好是unique site (避免cut vector)

         primer 2,3 design部分最好要變的點在中間，前後各延長10~15bp

         GC結尾，specificity較高

         以上我常用的方法，另外還可以用PCR的方法跑一整圈plasmid，

         然後用Dpn1 cut 再接，實驗室有人做，應該是ok

         有需要再提供給大家好了...我也沒實際試過 ^^""



--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 61.217.31.60
推 rickson:有錢的話直接去買mutagenesis kit，然後primer不需要純化
→ rickson:多挑幾個就好了
推 blence:何必買kit,以一般不易突變的pfu做PCR的reagent拿來用就ok了
推 liuse:我也都是用樓上說的    pfu  做完記得定全長確定其他沒錯
推 aggaci:好麻煩  直接quick change不就好了
推 HUVEC:我也是用quick change，不過貴一些就是了