推 meiosisLin:推最後一句話～～～～ 11/14 10:25
推 lainhat:好強喔 我只是置換基因就接了快1年了T.T 11/23 15:33
※ 引述《scherzoinb (scherzo in B Op. 20)》之銘言：
: 目前transform一直長不出來
: 在做完double digestion後
: 做ligation，插入一段insert
: transform 到competent cell裡
: 目前能確認的是︰
: 有做single digestion，確定enzyme都能切
: insert的切位是設計好的
: transform是用heat shock的方式
: 師說︰用電穿孔的效率比較高
: 還沒試過
: 找不到問題出在哪裡
: 做了快一個月
: 麻煩各位大大
: 幫忙一下
: 感激...
: 第一次做clone的新手...
電穿孔要使用cuvet..用完還要洗..個人覺得很麻煩
而且competent cell製作比較麻煩(以時間觀點來看啦..外加我很懶..XD)
基本上如果你要transform的大小不太大的話
能用heat-shock就用heat-shock
你應該在每次做的時候都加入一組control
control是什麼?就是你沒切過的vector..直接拿1 ul做一組heat-shock
理論上這一組應該可以長很多很多..如果沒長的話表示你操作有問題
要是長很少的話表示你這批competent cell效率太低
效率太低的話建議你重做一批..做cloning效率要是太差也很麻煩
另外..你做ligation的時候..insert:vector比例是多少..?
還有你vector size跟insert size呢?
此外..你ligation的條件跟時間呢?
ㄜ..其實我一般來說是根本不管他的size啦XD
反正就直接拿很多的insert+很少的vector...
每天下班前丟4度冰箱給他over-night..
第二天再來transform..或是把PCR設定成16度3小時
用PCR管子做ligation
不過大多我都是選擇overnight..時間比較好控制XD
第一次做會卡比較久啦..因為很多操作還不熟悉的關析
我第一次做一個成功的花了我三四個月吧..
然後就是無止境的做各種新的construct(實驗需要..(哭))
到目前為止已經可以達到兩週可以交出一個定序完整的construct了XD..
果然實驗都是做久就會熟練
PS:可是每次做完後又會多出新的來做..囧
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上帝曾經說過 :
當一個人打你右臉的時候
你就要用日耳曼背橋摔壞它的左臉
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