Re: [求救] transformation的問題

[scherzoinb (scherzo in B Op. 20)]

vector: pETBlue己接上要表現的gene，約4.5Kb
insertt: 做純化用的，his tag，約24bp
control沒做...會記得要做
ligation:
  vector:insert=1:3
  T4 ligase:16℃、16h (fermentas)
  total volumn: 10μl
competent call: nova blue

有人跟我說︰試試看把ligation的溫度提高到20 or 22℃
也有人說試試看用切enzyme去切5'端的phosphate

謝謝bluecsky大大給的意見...感激...
希望有經驗的大大...能多提供一些意見...謝謝...

※ 引述《bluecsky (我要藍藍淡淡的天空)》之銘言：
: 電穿孔要使用cuvet..用完還要洗..個人覺得很麻煩
: 而且competent cell製作比較麻煩(以時間觀點來看啦..外加我很懶..XD)
: 基本上如果你要transform的大小不太大的話
: 能用heat-shock就用heat-shock
: 你應該在每次做的時候都加入一組control
: control是什麼?就是你沒切過的vector..直接拿1 ul做一組heat-shock
: 理論上這一組應該可以長很多很多..如果沒長的話表示你操作有問題
: 要是長很少的話表示你這批competent cell效率太低
: 效率太低的話建議你重做一批..做cloning效率要是太差也很麻煩
: 另外..你做ligation的時候..insert:vector比例是多少..?
: 還有你vector size跟insert size呢?
: 此外..你ligation的條件跟時間呢?
: ㄜ..其實我一般來說是根本不管他的size啦XD
: 反正就直接拿很多的insert+很少的vector...
: 每天下班前丟4度冰箱給他over-night..
: 第二天再來transform..或是把PCR設定成16度3小時
: 用PCR管子做ligation
: 不過大多我都是選擇overnight..時間比較好控制XD
: 第一次做會卡比較久啦..因為很多操作還不熟悉的關析
: 我第一次做一個成功的花了我三四個月吧..
: 然後就是無止境的做各種新的construct(實驗需要..(哭))
: 到目前為止已經可以達到兩週可以交出一個定序完整的construct了XD..
: 果然實驗都是做久就會熟練
: PS:可是每次做完後又會多出新的來做..囧

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◆ From: 134.208.24.190
推 elgase:你是指,你要insert的是24 bp的片段?
→ elgase:那為什麼不直接用PCR的方式將his taq接在gene5'或 3'就好?
推 scherzoinb:PCR？？不太懂...能說詳細一點嗎？謝囉...
推 meiosisLin:primer帶His的seq...就可以用PCR方式作了.....
推 meiosisLin:insert量/insert長度=Vector量/Vector長度..insert太小
→ meiosisLin:比率會非常懸殊....不好做..
推 elgase:感謝m大的說明~我原本想畫圖,可是我實在不會用bbs畫圖(囧)
推 jjogp:看你目的 subclone到其他expression vecto似乎會比較方便
推 HIbaby:推樓上 因為還有其他vector可用,
推 scherzoinb:因為另一個人有做出來，切位跟我的一樣，insert一樣
→ scherzoinb:只是表現的gene不一樣，師說...可能手的問題...