Re: [問題] Real-time PCR

[Phaeton (凰呀的鳴叫~)]

請問一下喔
因為想了解Q PCR
所以爬文找知識
看到這篇裡面提到的重要公式

我在知識+和GOOGLE都找不太到
可以請哪位大大解釋一下
Y是什麼??

而N應該等於多少？？
ＣＴ值嗎？？

另外我可以用斜率的方式來看ＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹ嗎？？
就是用 Y = MX + B的方式來看　
Ｍ應該要等於多少才會有最好的效率？？

謝謝

※ 引述《rpr (Cathy)》之銘言：
: ※ 引述《bloodgas (奶油ˊ的夢)》之銘言：
: PCR有一個重要的公式
: y=(1+e)^n  e是PCR反應的效率,而n次方指的就是cycle number



: 就我所知real-time PCR,是希望每一個PCR反應能盡量達到 e=100%
: 所以才會限制產物大小 (<250 bp) 跟反應溫度(2-step PCR)
: 當然對於template的要求也是非常的高
: 如果你的template quality不佳,做出來的結果常常會認你吐血
: (我在做基因定量,range只有1-4 copies,但是Ct差個1結果就差兩倍,真的會吐血
: 觀察國外這方面做的好的實驗室,對於template的quality要求是嚴格到不行)
: 如果你都按照他的限制下去做,基本上他們是可以保證一定可以得到很好的結果
: 但是溫度是絕對可以調整的
: 如果你的基因在3-step PCR做的2-step PCR還好,當然沒有理由不調整溫度
: (這又牽涉到primer的設計,所以他們也出了一套軟體專門幫你設計適合的primer)
: 只是你要確定這樣條件下的e比他們條件下的e來的好
: 另外,反應體積也是要盡量精確,因為reagent裡還有ROX dye,
: 機器會在判讀時拿這個螢光作為不同well之間體積的校正
: (但是怎麼校正我就不清楚了,有興趣者可以自行測試,再來跟大家分享嗎?)
: 不過一我的經驗,差個1-2 micro-liter是影響不了多少啦!(我做25 micro-liter的)
: RT Real-time我也做過,用的是TRIzol抽的
: OD 260/280實在不怎麼好(說來慚愧,1.6我就歡天喜地了)
: 但是也都做的出來
: 剛開始還傻傻的買他的one-step RT-PCR reagent(貴到爆)
: 後來也開是自己轉(我用過BD以及invitrogen的kit)
: 但是結果仍然滿意,所以抽RNA跟RT的kit應該是影響不大
: 反而是你操作的好不好的問題
: 另外你的反應做大於40 cycle,然後Ct只會在40以後出現
: 我也如bloodgas大大會建議你看一下internal control的Ct會在多少出現?
: 可以一併確認是quality的問題 或者你的基因表現就是低到不行
: 希望對你有所幫助
: : 1.是的,要盡可能精準
: : 2.我們實驗室用的是Roche的機器,不過所有program的溫度跟時間都可以調整,因為每一個
: :   基因都不一樣,同樣的條件不可能適用於所有PCR,所以一定要optimization,ABI機器
: :   沒用過,所謂的不能改條件意思是????
: : 3.RNA用column抽或是TRIZOL抽都一樣,quality沒問題,reverse transcription只要沒有
: :   RNase污染就沒問題
: : 4.要check RNA quality就直接跑個gel來看,28S/18S的band正確,比例也正確就可以
: : 5.crossing point 40是太低了,應該就是沒有東西吧...你測過抽出來的RNA的濃度嗎?
: :   你是用多少total RNA下去做reverse transcription? 一般都用0.5-1 ug, 另外,
: :   你做過house keeping gene的real-time PCR嗎?這樣可以直接確定你的cDNA有沒有問題.
: :   還有一點就是可以加上一個positive control,plasmid或是PCR fragment,這樣才能
: :   確定至少real time PCR的過程沒有問題..
: : 以上

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◆ From: 140.129.77.1
推 freesoul:y: yield; n: number of cycles
→ freesoul:另外我完全看不懂你y跟斜率那邊的意思; e理論上是一個
→ freesoul:定值 (1<=e<=2) 跟斜率一點關係都沒有啊!
推 freesoul:你可能根本就誤會qPCR的原理了  建議從頭從PCR的原理思考
→ freesoul:一次 q-PCR基本上就是"很精確"的PCR而已
→ freesoul:note: "e" depends on primer/template; it's constant
→ freesoul:intraexperimentally, but should be variable inter-
→ freesoul:experimentally
推 freesoul:抱歉 突然想到 照上面的公式的話e應該是 0<=e<=1
推 freesoul:y=(1+e)^n  括號內的值介於1和2之間
→ freesoul:希望這樣講你會明白