Re: [求救] transformation的問題

[wangba (原來...)]

※ 引述《bluecsky (我要藍藍淡淡的天空)》之銘言：
: 用PCR的方式就是你要重做整個insert
: 也就是你要做his-tag+insert這整個DNA
: 不過似乎跟你原本想要的方式又多了一道手續
: 因為必須重新PCR做insert
: 這樣接好之後還是必須重新送定序
: 要是原本的gene長度比較長..有時候會容易出現一些mutation
: 假如是要用his-tag..為什麼不找方便的切位直接切下
: 接到含有his-tag的expression vector呢?
: 因為如果真的只有24 bp的話..
: 我還沒接過這麼小的XD..不知道會不會有什麼問題產生

  如果怕PCR會產生mutation  其實可以試試用primer架橋的方式

  圖示如下:

  BamH I                               EcoR I

  G GATCCctctgttcaac ggggacatgctctg ttcaacggggacatgG AATTC
  CCTAG Ggagacaagttgcccct gtacgagacaagtt gcccctgtacCTTAA G

  如上圖所示  小寫部分是欲加入的小片段

  可以分成六條primer 用BamH I和EcoR I處理過vector之後

  將合成的primer加入一起做ligation

  記得primer 5端要先磷酸化  也不可以用CIP處理

  可以試試看  加油


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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 140.123.86.42
推 scherzoinb:這我還是第一次聽見耶...分生的知識不足...唉...
推 scherzoinb:CIP是不是用在blunt end，sticky end不能用這個是嗎？
推 scherzoinb:謝謝你囉...感激...
推 bluecsky:應該說blunt end比較需要CIP處理一下
→ bluecsky:CIP是去掉5'的磷酸..避免兩個blunt end成self-ligation
→ bluecsky:sticky end不是不能用..而是不需要..
→ bluecsky:因為兩個都是stick end的話是無法self-ligation的
推 skylawer:樓上有一點點語病 是指兩端是不同 cutting site 比較精確
推 bluecsky:哈..感謝樓上幫我補正