[心得] 以Real-time PCR偵測 microRNA

[soom ()]

最近花了一點時間在測試matured miRNA的PCR偵測法

有點心得可以跟大家分享


由於miRNA是只有23~27 nt大小的RNA片段

無法直接使用一般PCR去偵測，所以必須要想辦法將之延長

常見的作法是接上linker或者使用特殊的RT primer

我們Lab試過的方法有兩大種，都包括Kit以及後來自行modified的方法

第一種是先將RNA用Poly A polymerase加上oligo(A)

然後用加上linker的oligo(dT)RT primer做fisrt-strand synthesis

如此做出的cDNA大致上會到80~90 nt

之後就可以使用matured miRNA的sequence當作forward primer

(當然，U要用T代替)，Linker上面的sequence當作reverse primer

就可以進行SYBR green I based 的qPCR

這種方法的Kit 可以參考I廠的 nCode


第二種是使用特殊的stem-loop RT primer

此RT primer全長約50 nt，前面6 nt需要和目標miRNA互補，後面則形成stem-loop的結構

這樣子產出的cDNA是約~75 nt

可以使用位於stem-loop中間偏後位置當reverse primer

miRNA扣除末5 nt的sequence當作forward primer

也是一樣可以進行SYBR green I based的qPCR

而若是需要probe，可以取miRNA跟RT primer間的sequence

這種方法的Kit請參考A廠的Taqman assay



把各種方法特點表列如下

              第一種  |   第二種 |

poly A       required        x

RT-primer   universal     specific

F primer     specific     specific

R primer    universal     universal


使用時的感覺，若是使用primary tumor cell

則會發現第一種方法的melt curve非常混亂

但是stem loop法就比較單純的單一波峰，做出來的SD也比較小

若把kit也考慮進來的話大致上用起來的感覺是

(註: 此為本人使用心得，不一定具代表性)

            優   >>>>>>>>   劣

價格       I廠  <= 1  <  2  << A廠

SD         A廠  <  2  <  1  =  I廠

時間       A廠  <= 2  <  1  =  I廠

偵測能力   A廠  =  2 >>> 1  =  I廠


C/P值     2  > A廠  > I廠 >  1


若是預算不用考慮的話，A廠會是省時間的好選擇

若是有時間設計primer的話 2 可能是比較好的選擇


以上所述  歡迎多多指教鞭笞

若是有需要RT primer的sequence可以再找我


參考資料:


1. http://www.protocol-online.org/biology-forums/posts/16271.html

2. Caifu Chen, Nucleic Acids Research, 2005, Vol. 33, No. 20 e179


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◆ From: 140.129.77.155
推 HIbaby:m一下
推 boxiaokai:第一種方法RT的時候 可以在oligo-dT的3'端加上兩三個mer
→ boxiaokai:的dN  這樣使PCR的產物為固定長度
→ boxiaokai:能夠減少melting curve混亂的現象
推 fungo:很詳細!A跟2有better specificity的優點
→ fungo:但相對的因為RT就是用miRNA specific的primer
→ fungo:所以出來的cDNA產物也不能像I或是1可以用來偵測其他miR
推 soom:其實我用1去測的時候CT都接近undetectble，但改用2可拉到~25
推 soom:所以我才會比較推2跟A   因為用1如果測不到也是白搭呀..