推 ad1980:第一點的據說很有意思，下次試試看，感謝。 12/03 00:42
※ 引述《ad1980 (Apoptosis)》之銘言：
: 想問板上有沒有人用過這個kit。
: 我家的是用Pfx PCR 過後，直接拿pcr product
: 用TOPO ZeroBlunt，但是呢...
: 實驗室的人，不是全都是false positive，
: 有 colonies 沒insert，
: 就是一個colonies都沒有，
: 老闆問了廠商之後，他們說可能是kit又問題，
: 就送了一個新的來，
: 可是還是一樣的問題，
: 後來老闆買了新的enzyme再試，
: 結果一樣。
: 老闆說：This is weird, I really dont know what's wrong with it.
: 當然我也遇到一樣的問題，
: 但是比實驗室其他人幸運一點，
: 長出來的唯二colonies有insert，
: 我的labmate還在奮戰，所以想問大家有沒有遇過類似的問題，
: 我不想以後還需要做cloning的時候，
: 又遇到同樣的問題。 @@...
: 如果有人知道問題所在，
: 麻煩指點一下，感激不盡。
有時候會出現這種問題，
目前經驗是..
第一，讓你的insert gene設計成不要插進去之後會跟vector上的sequence in-frame,
因為pBlunt設計的接入點，剛好把一個suide gene切開，
如果vector自己self-ligate菌會死掉長不起來，所以據說，
如果你的東西一直長不起來的話，可以在insert多加一或兩個nucleotide，
改變coding frame，可能會有用吧
第二，要小心使用competent cell，這點我自己沒遇過，可是有聽其他人說，
kit有自己建議的competent cell，似乎不見的每一種都適合。。
以上，參考看看囉～～
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