[求救] Phosphoprotein的western

[tsubasawolfy (悠久の翼)]

最近新買兩隻QIAGEN的Anti-phosphoserine跟Anti-phosphothreonine弄得很困擾- -

因為Background一直過高．．．(第一片海苔就獻給它了．．)

高到肉眼就可以看見membrane整片都發光(serine最嚴重)

不過band還是可以看的清楚(３０秒以下可以　壓３０秒以上就會無法辨認)

Blocking跟一抗二抗的條件都照它Hand book寫的操作




Blocking:1X TBS, 5% BSA,RT,2hr (hand book是寫1hr..至於RT跟4度C都試過　沒有差異)

First Antibody:1X TBS,5% BSA+0.1%Tween 20, 4度C, O/N
(Serine-mouse IgG,IgM  Threonine-mouse IgG)

Second Antibody:1X TBS, 10% milk+0.1%Tween 20, 2hr
(Cell signaling, Anti-mouse IgG)



做膠跟跑膠的buffer也都重配(running buffer跟transfer buffer不回收)

hand book的trouble shooting也只寫background過高是因為BSA　blocking能力不好
所以二抗才會用10%milk補強(也沒寫解決方法= =a)

目前自己有嚐試過降低１抗濃度　從廠商預設的1:100-1:200降到1:500
不過海苔還是一樣一分鐘就烤好了Orz

還有幾個方案(還沒試)
1.提高blocking跟一抗的BSA濃度(5%->10%)
  -這不知道有沒有用..

2.blocking時間延長
  -這感覺比較沒用　因為一抗也是用同濃度BSA配還overnight

3.一抗濃度降更低　1:1000試試看

4.一抗不要O/N　試個2-4hr看看

目前就只想到這幾個　不知道還有沒有哪位先賢可以提供一下其他改進意見..Orz
(買新抗體除外= =)

ps至於是否可能二抗亂抓的問題．．有用其他Antibody測試過沒有亂抓的問題

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 124.8.178.224
推 blence:你有沒有想過BSA其實都是有phosphorylation的form?
推 racher:我以為是caseinh才會有phosphorylation form耶!!
推 tsubasawolfy:一樓的問題我有想過 但是他hand book上面沒有寫明
→ tsubasawolfy:要哪種BSA..所以我是直接買新的SIGMA-BSA 98% 電泳級