※ 引述《bluehttp (蝦毀)》之銘言：
: 最近在做cloning,
: 做到快發瘋了.
: 我用 XhoI 及 Hind III (biolabs),
: 去切 insert 和 vector,
: 跑電泳也確定有切動,
: 之後用T4 DNA ligase 進行 ligation, 然後overnight,
: 隔天再transform (DH5a),recovery 1hr,塗plate, overnight.
: 可是隔天來看沒有長.....
: 我有試過用 fermentas 的 ligase 及 biolabs 的 ligase,
: 可是一樣都沒長,
: 不知道尚有哪些細節我沒注意到,
: 希望有經驗的大大可以幫助我阿!
1. 切的時候 是一起混切？ 還是先後切？
2. 切完後 再經膠體純化後，DNA sample 是否還在？
3. ligation時，大小片段混合後，加入buffer前是否先45℃加熱再冰浴？
全程是否冰浴操作？有沒有再額外加入1mM ATP? 大小片段混合比例是否正確？
(po 一下 你的步驟)
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※ 編輯: wensing 來自: 124.8.73.77 (12/12 02:36)
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