推 wensing:已回信！ 12/12 10:48
推 bluecsky:我overnight都用4度C 12/12 12:54
→ bluecsky:加熱是因為BUFFER會有沉澱的關係吧 12/12 12:55
推 jsi:ligation buffer含ATP 因此通常會分裝成數管 避免多次解凍冷괠 12/12 22:23
推 jsi:凍 導致ATP失去活性 而影響ligation進行 12/12 22:27
※ 引述《wensing (潛力股)》之銘言：
: ※ 引述《bluehttp (蝦毀)》之銘言：
: : 最近在做cloning,
: : 做到快發瘋了.
: : 我用 XhoI 及 Hind III (biolabs),
: : 去切 insert 和 vector,
: : 跑電泳也確定有切動,
: : 之後用T4 DNA ligase 進行 ligation, 然後overnight,
: : 隔天再transform (DH5a),recovery 1hr,塗plate, overnight.
: : 可是隔天來看沒有長.....
: : 我有試過用 fermentas 的 ligase 及 biolabs 的 ligase,
: : 可是一樣都沒長,
: : 不知道尚有哪些細節我沒注意到,
: : 希望有經驗的大大可以幫助我阿!
: 1. 切的時候 是一起混切？ 還是先後切？
: 2. 切完後 再經膠體純化後，DNA sample 是否還在？
: 3. ligation時，大小片段混合後，加入buffer前是否先45℃加熱再冰浴？
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這一步是為什麼? 完全不懂
: 全程是否冰浴操作？有沒有再額外加入1mM ATP? 大小片段混合比例是否正確？
: (po 一下 你的步驟)
1.Hind III 及Xho I 一起切, 37度 overnight
2.run gel,gel extraction (bioman)
(在gel extraction後,我有跑電泳,確定DNA還在)
3.ligation,體積比insert/vector = 7:1
(我用的ligation buffer本身就含有 1mM ATP)
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