※ 引述《siberianiris (紫色鳶尾花~)》之銘言：
: 請問各位有在做EMSA的大大們
: 我用Roche DIG的系統 自己label的probe大約150bp
: (這段序列缺少 在我報導基因的數據中 是活性下降最多的一段)
: (用這段去做EMSA 有看到binding band 而且加unlabel 也能被競爭)
: 所以我去預測上面的TF結合位 然後合成幾組短短的oligonucleotide
: annealing後 在binding的反應中 分別加進去當作competitor probe
: lane 1: DIG-probe(150bp) only
: lane 2: DIG-probe + nuclear extract
: lane 3: DIG-probe + nuclear extract + competitor probe(沒有label)
: .
: .
: .
: lane X: DIG-probe + nuclear extract + competitor probe X (沒有label)
: 結果出來 原本lane 2有band的地方 在加入X後 band就消失了
: 顯示 X的序列 好像是band 結合的主要位置
: 於是我將X的序列 做了點突變 然後照樣合成短短的 competitor probe X mut
: 再做一次EMSA 發現lane 2的band又出現了
: (也就是lane 2 有band ; 加X後 band消失 ; 加X mut band又出現)
: 那麼請問一下 如果做到這邊 能否代表 X 就是調控這段活性主要的TF ???
到這邊為止只能說可能是
真要確定作個supershift或DAPA去證實妳預期的蛋白質真的有在上面再說
若真的如你預期她真的在上面
還得做個reporter assay結合overexpress or RNAi transfection
才能肯定你的假設
: 將來如果去做 X 點突變的reporter construct 那活性是不是就會下降??
: 誠心請問有相關經驗的人 能分享一下
: (>_<非常緊張這結果代表的意思 到了睡不著覺的地步了 T_T)
: 此外, 我跑出來的band 看起來都糊糊的 沙沙的感覺 @@
: 不知道是哪邊的問題呢？
: 先謝謝大家看完 ^^
--
http://www.wretch.cc/blog/aggaci
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.114.100.165