Re: 切膠回收做PCR

[sGoat (無三小羚羊)]

※ 引述《reteporeh (颱風也喜歡放假)》之銘言：
: 想請問板上的各位
: 有將PCR產物做膠回收然後再進行PCR嗎?
: 目前遇到的情形是
: 膠回收完的產物再進行相同條件PCR時
: 在跑膠確認時,沒有看到任何的band
: 重複做過幾次,情形依然
: 想請問在做完膠回收後
: 再進行PCR時
: 有什麼條件特別要求的嗎?
: PS..膠回收是使用Kit做的

sorry...
我的意思是為什麼要在PCR完之後跑膠回收"再跑一次PCR"...
(膠體回收也要看的到產物在哪裡吧?純粹猜測位置再切膠回收要是沒產物不就做白工?)
假使你的primer設計得夠專一的話...
單純考慮擴增量不夠...
將你的PCR產物稀釋50倍之後再以同一組primer進行PCR擴增...
(甚至是使用更專一的Nest primer擴增)
就能將你第一次沒被放大到可見程度的產物再放大一次...
一直持續到你所要的產物被放大到你要的量...

假設是擴增要進行ligation的片段...
  那你的RE切位一定設計在primer上...
  (此句修正,要外加切位才是在primer上)
在沒有產物的情形下,為何不先考慮PCR是否成功?

再假設你進行了PCR擴增ligation的片段...
你得到了產物,你將產物以RE切過了
跑了膠回收完,你想要確認回收到的是不是你要的片段...
因此以相同的primer又跑了PCR想說要是同樣的東西應該有東西會P出來...
可是你的template上primer相對應的黏接位置已經被你用RE切掉了...
那你怎麼能夠預期PCR能夠P出東西來呢?

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 210.69.150.30
推 rangelovero:最後兩句不太對喔~不會因為RE切過就放不出來
→ rangelovero:primer上目標片段與外接切位比例約2:1 or 3:1
→ rangelovero:扣除切位的base專一性就已足夠P出東西了
→ sGoat:感謝指正,所以我想原PO應該要仔細敘述一下實驗流程...
→ sGoat:因為影響的點太多了...
※ 編輯: sGoat           來自: 61.221.60.215        (01/05 14:30)