Re: 切膠回收做PCR

[reteporeh (颱風也喜歡放假)]

謝謝大家的回覆
因為我目前的問題在於說切膠回收後的產物無法再次PCR出來
而第一次PCR的產物跑膠是有major band的
只是將major band切膠回收後
再次PCR完後,跑膠卻跟L大的情形一樣
沒有band的出現

所以我想要知道的是否在回收的產物
再次進行PCR是否有什麼地方要特別注意的

ps..而s大所說的情形似乎跟我的有點不太一樣,所以那些因素應該都可以初步排除


※ 引述《sGoat (無三小羚羊)》之銘言：
: ※ 引述《reteporeh (颱風也喜歡放假)》之銘言：
: : 想請問板上的各位
: : 有將PCR產物做膠回收然後再進行PCR嗎?
: : 目前遇到的情形是
: : 膠回收完的產物再進行相同條件PCR時
: : 在跑膠確認時,沒有看到任何的band
: : 重複做過幾次,情形依然
: : 想請問在做完膠回收後
: : 再進行PCR時
: : 有什麼條件特別要求的嗎?
: : PS..膠回收是使用Kit做的
: sorry...
: 我的意思是為什麼要在PCR完之後跑膠回收"再跑一次PCR"...
: (膠體回收也要看的到產物在哪裡吧?純粹猜測位置再切膠回收要是沒產物不就做白工?)
: 假使你的primer設計得夠專一的話...
: 單純考慮擴增量不夠...
: 將你的PCR產物稀釋50倍之後再以同一組primer進行PCR擴增...
: (甚至是使用更專一的Nest primer擴增)
: 就能將你第一次沒被放大到可見程度的產物再放大一次...
: 一直持續到你所要的產物被放大到你要的量...
: 假設是擴增要進行ligation的片段...
:   那你的RE切位一定設計在primer上...
:   (此句修正,要外加切位才是在primer上)
: 在沒有產物的情形下,為何不先考慮PCR是否成功?
: 再假設你進行了PCR擴增ligation的片段...
: 你得到了產物,你將產物以RE切過了
: 跑了膠回收完,你想要確認回收到的是不是你要的片段...
: 因此以相同的primer又跑了PCR想說要是同樣的東西應該有東西會P出來...
: 可是你的template上primer相對應的黏接位置已經被你用RE切掉了...
: 那你怎麼能夠預期PCR能夠P出東西來呢?

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◆ From: 220.129.166.142
推 tsubasawolfy:不太懂為何要再PCR一次
推 NKTcell:再跑沒band的話 可以將膠純化的DNA直接跑膠試試看 看是否
→ NKTcell:有純化成功 如果是PCR方面的問題 p的時候記得要另外加dNTP
→ NKTcell:也要記得做不同倍的dilute　以免跑出來都是smear
推 sGoat:有沒有考慮過P出來的band不是你要的產物?
→ reteporeh:恩恩..有這樣想過..但是很奇怪的是回收再跑PCR就沒有
→ reteporeh:但是不回收將PCR產物取出一點點,再跑PCR就有band了= =
→ reteporeh:回N大,回收後跑膠是有band的,PCR也是有另外加dNTP的
推 sGoat:試試將回收的DNA跑膠看看有沒有回收成功,或是偷懶的測一下
→ sGoat:DNA濃度,先看回收有無成功,若沒有成功,考慮DNA可能留在kit的
→ sGoat:膜上,這時候考慮的是藥物PH值對不對,還有回收片段的大小
→ sGoat:我之前用的回收kit有說大於2K以上的片段回收需要不同方法
→ sGoat:至於詳細內容忘了=.= ,不知道你是不是在clone,因為我之前有
→ sGoat:這種情形. 稀釋有出來回收沒出來,其中差別在你稀釋的裡面有
→ sGoat:你第一次跑的原始template,回收則只有你挖的band,參考一下..
推 sGoat:如果後續動作要定序,你錢滿多的話...定一根吧XD(可能會被殺)