[求救] EMSA 的基礎問題

[cytospin (My Ernest)]

最近要幫lab的其他研究生做EMSA 因為他一直做不出來

老師已經失去耐性了

我之前也沒有做過  這兩天在研究potocol

想請教一下大家的意見

首先dsDNA 我看古人的設計只有25bp (之前的postdoc看paper做的)

請公司替我們label biotin之後泡成400uM的濃度

問過隔壁lab的人  他們告訴我就用40 nM forward 50 ul + 40nM reverse 50 ul

所以這樣我的final 濃度就是20nM  (這樣對嗎??)

上面蓋上礦物oil  然後放在一個兩L的水中加熱

水滾了之後兩分鐘   讓他自然冷卻 O/N

pierce上面建議biotin-labled DNA放4fmoles

所以我就是20nM放  2 ul 就應該會是4fmoles

我的疑問是

大部分的核蛋白都是放多少阿

蛋白和DNA的比例到底是如何制定出來的??

還有古人設計的25 bp會部會太小了一點阿   會有什麼二集結構的問題嗎??

我看上面還有很多optimal用的reagents

我是想說先至少看到band再說

請有經驗的大大分享一下經驗

有關於DNA  vs protein的比例

想要第一次就做成功阿......


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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 75.185.92.118
推 hosaile:我自己的經驗是核蛋白的量要做過測試才知道最適合的量
→ hosaile:每個protein對上不同sequence的結合能力本來就不同
→ hosaile:不過我第一次試的時候放的量分別是 1ug, 3ug, 5ug, 10ug
→ hosaile:給你做參考  祝你實驗順利囉
→ hosaile:喔對了 我想DNA那麼短是不太可能出現二級結構啦
→ hosaile:就算有的話 佔所有probe中的量一定也很少 反正不會被bind
→ hosaile:所以不用擔心囉!
推 viroid:Oligo的大小通常最高可以到70bp
→ viroid:但是oligo太長，就必須要用HPLC純化，會貴很多
→ viroid:不然就是要自己跑膠純化
→ viroid:此外 probe越長，可能會有不只一個蛋白質跟DNA結合
→ viroid:如果不是oligo，而是用DNA fragmet當probe，最長可以到250b
→ viroid:更長就會因為太多protein binding而很難得到什麼資訊