Re: [問題] TOPO cloning

[bluecsky (我要藍藍淡淡的天空)]

※ 引述《ad1980 (Apoptosis)》之銘言：
: 之前有問過 TOPO 的問題，
: 現在又有了，想問問看有沒有人知道。
: 就是阿... 我把 pcr 接到 Topo vecter 上之後，
: transform 到 E. coli 裡。
: 但是呢... 隔天出來的 colonies 幾乎都是 template vector...
: 明明就只有用一點點做 pcr, 接的時候也只拿 pcr product 的 2ul/50ul,
: template 的量應該是少得可憐，
: 可是 transformation 出來，存活的 colonies 都是 template。
: (很不幸我的 template 跟 Topo vector 一樣都是 Kan resistent)
: 我 labmate 的問題也是一樣，
: 最後他的解決辦法就是把要 pcr 片段從 template vector 切下來，
: 再用那個片段去 pcr 才解決這個問題，
: 可是這樣很麻煩，難道每次用 Topo 都要這樣嗎？
: 有沒有人遇過同樣的問題，或是知道為什麼會出現這種情形。
: 為什麼 bacteria 那麼喜歡 template vector,
: or 那麼討厭 topo vector？
: 感謝。

這問題很好解決...多一點點步驟而已

你就把PCR product拿去跑gel 再切gel上的band來純化

就可以做好了..當然你要先切下再跑PCR也一樣

雖然麻煩但是沒辦法..因為這種vector轉入的效率本來就比較好

加上如果你用的是一整套TOPO kit..裡面附的comptent cell效率又更高

至於為啥更愛這vector?..原因很多阿..可能你TOPO vector比他大

比較小的vector會比較好轉..又或者是你TOPO接的效率不夠高

by the way..這種純的vector大多只要用不到0.1 ul就可以轉出一大堆了..

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◆ From: 59.112.214.105
推 shunze:那為何不用另一種抗生素篩選?我記得TOPO有兩個
→ bluecsky:我用的TOPO是有amp跟kan這兩種..
推 ad1980:我 labmate 試過拿 pcr 去 gel extract，結果一樣，所以
→ ad1980:她才試把片斷先切下來，主要是要讓 temlate 沒辦法存活
→ ad1980:我們實驗室用的只有 kan 而以...
→ ad1980:可是我之前用 pGEM-T system 都沒有這種情形耶...
→ ad1980:我的 template 比較大，快 8kb...
→ ad1980:我們是用一整套的，不是少少幾顆，就是很多但都是 template
→ ad1980:才想說 Topo 跟其他比起來那麼不受 cell 歡迎阿？？
推 MrCAKE:在原本template上的抗生素基因中間切一刀如何
推 ad1980:to 樓上：對厚... i will try it tomorrow~