Re: [求救] 有關大量表達蛋白的問題

[aggaci (情人節ㄧ直被閃)]

※ 引述《artery (酸糖果)》之銘言：
: 用E.coil來大量表達蛋白
: 經由超音波破菌
: 分離supernatant及pellet
: 而所表達的蛋白可能位在supernatant 或pellet
: 請問各位高手
: 假設蛋白表達在pellet，想要讓蛋白轉成表現在supernatant
: 有什麼方法或技巧？
: ps：就我所知就是降低誘導的溫度，但是我試過30,28,16度
:     但還是沒有成功，不曉得還有什麼該注意的
:     或是其他小小技巧，請各位高手提供妙計
:     謝謝！

  1.換host 如Rosetta-gami (DE3)可以幫助雙硫鍵形成，
    比較不會形成inclusion body
  2.降低IPTG濃度甚至不加
  3.菌養在低溫(16度)，shaking 慢一點
  4.加些許ethanol，可以幫助誘導HSP表現幫助folding
  5.fusion GST or MBP or GFP...可以有效幫助蛋白質變soluble protein

  以上我都試過，5效果最好
  除非不得已，不然別碰refolding

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http://www.wretch.cc/blog/aggaci

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 140.114.100.165
推 tsubasawolfy:原來還有4這個　GST老闆是說casebycase
→ tsubasawolfy:refolding也試過(我的蛋白)．．DEAD END
推 artery:請問一下，ethanol是用多少量？
→ artery:還有我的蛋白後面不能再加其他的東西，因為我要結晶用的
→ artery:所以我的蛋白就是後面再加histag而己
→ artery:16度我是加0.1mMIPTG，O/N，但還是失敗
→ artery:所以請問一下你們在做的時候是誘導多久的時間？
推 zytase:加其他東西可以再切掉阿...只是比較麻煩而已~~
推 yuchipeter:換 RIL or RP ? 只能多方嚐試...重組蛋白case by case