[求救] Co-IP

[cytospin (無心)]

請問一下比較好的Co-IP lysis buffer使用什麼比較好

現在我就是用普通的lysis buffer (Tris, NaCl, EDTA, 10%glyceral, 還有一堆inhibitor)

可是做出來效果不是很好


想說會部會我的lysis buffer太強了  (我似乎有看到有人用tritonX-100做)

把pt-pt interaction也都打破了

我的做法如下:

1. 3x 10^7 cells lyzed in 500 ul lysis buffer, 4C, rock for 45 min

2. Spin down 20 min

3. sup preclean with Trueblot anti Rabbit beads 30 min

4. Add 5 ug of primary Ab,  4C rock   O/N

5. add 50 ul beads 1hr, rock , 4C

6. wash twice,

7. add 2 X loading buffer , heat 10 min

8. spindown, loading

hmm.....大概就是這個樣子


請問Co-IP達人

有沒有比較好的建議??

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 75.185.92.118
推 blence:lysis buffer沒有detergent，沒外力應該很難破吧？
推 lblackpig:如果目標是cytosolic protein，用TE再用sonicate