Re: [求救] cloning 失敗好多次 就是接不起來...

[ROKEE ( Beanazai)]

※ 引述《pop6234 (表面的和平)》之銘言：
: 我的insert大概是1400bp
: vector是pAS2-1 (Clontech)
: 切單刀
: 所以有用CIP處理vector
: 切完酵素之後跑電泳切膠
: gel extraction之後
: 再做ligation
: 16度C overnight
: 因為我的insert量很少
: 所以我insert跟vector的ligation比例用
: 3:1  3:0.5  5:0.5
: 還有做vector的(切完酵素之後再ligation)
: 可是
: transform之後
: 盤上一顆也沒長
: vector only的也沒長...
: 本來老闆覺得是我技術不好
: transform有問題
: 所以我上次有多做一組沒有切過酵素的vector
: 那次就那盤沒切接過的有長而已

  那這組positive control長出來的colony數有合格嗎?

: 如果說是我ligation的比例不好之類的
: 我都可以接受
: 可是
: 連vector only的都沒長
: 讓我真的不知道該怎麼改我的實驗
: 想請教大家連vector only 的都沒長有可能是什麼原因?

  vector是人家給的吧? 凡是自己沒有確認過的東西都先別相信是真的

: buffer之類的都是公用的
: 別人的clone都有長
: 就我的長不出來...

  這問題常出現在剛入實驗室的新人身上

  先不就接進去的這片段是否有細胞毒性
  (就算是要順利表現活性的機率也超低,但我就衰到碰過)

  小弟我覺得要先檢討你的transformation efficiency

  這包括了compotent cell置備
  (貴實驗室若是$$多買現成heat shock的效果也絕不會比用eletroporation的好)

  另外送入DNA的質與量是否足夠



  我個人覺得，拿不到clone多和個人手法有關.......

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蓋圖書館超痛苦

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◆ From: 218.34.28.233
推 bluecsky:唉..clone做出來結果不表現真是很慘..
推 borhen:compotent cell 是決定性的關鍵
→ borhen:我都是自己做  隨便接隨便都會長 比例根本不是重點
→ borhen:eletroporation沒試過 所以無從比較
→ borhen:我覺得 你要不要一步一步 CHECK 這樣比較容易發現問題再哪
推 huhu126:從頭ㄧ步步check吧,有任何selection marker可以辨識嗎?