Re: 有關純化的問題

[aggaci (小提琴的連弓真的好難阿)]

※ 引述《aggaci (小提琴的連弓真的好難阿)》之銘言：


  最近從pichia medium收集蛋白質
  因為量太多了
  所以我用80%的硫酸銨把它抓下來後
  過nickle resin進行純化
  等到我覺得我洗的很乾淨了，再以高濃度的imidazole 進行 elution
  出來的都黃黃的，根據以前的經驗，通常降子蛋白質都很多
  但是以20 micrliter跑電泳只有一點點，沒什麼雜蛋白
  (western blot結果是有東西的)
  後來拿去dialysis  顏色也沒變淡.....

  那顏色到底是什麼造成的？(濃縮後變成深咖啡色)
  拿去用BCA測濃度   測出來有10mg/ml.........Orz..
  拿來跑電泳根本沒那麼多

  因為我第一次做皮奇亞的實驗，所以很多都不太懂
  有沒有高手能指導一下哩
  謝謝



--
http://www.wretch.cc/blog/aggaci

--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.114.100.165
推 Ren:probably contains metal(s).  Use UV-VIS to test OD 300-500
  直接測嗎？不需要加任何reagent嗎？


推 ROKEE:這東西超臭的XDDD   原po原敲完硫銨、透析後有過mino-pore??
→ ROKEE:那些可能是代謝產物,畢竟這是可以長到OD600=200的菌
→ ROKEE:而且產量不高的原因很多,medium.菌株.methonal誘導時間,etc.
→ ROKEE:更正 mini-pore, methanol     (爛鍵盤害我一直打錯= = )
  請問你說的是過0.2 filter嗎？

推 pichia:當初transfromation時候 有用Zeocine挑表現量較高的菌株嗎
  我的vector是pPIC9，不是抗zeocine
  當初有幾顆都有表現(小量)  我是挑表現量最多的去大量表現
  而且很多都在胞內....Orz..有種衝動想把他打破純化...="=

推 cypher0623:哇~ 本尊都推文了
--
http://www.wretch.cc/blog/aggaci

--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 140.114.100.165
推 jjlee:打破純化你會哭...  雜蛋白質多到要extra colunm來去除
推 sqqs:分泌蛋白的glycosylation也要考慮 多年前我看過paper
→ sqqs:有提到glycoprotein比較不易被comassive blue染出來...
→ aggaci:真的嗎？！？請問是哪一篇paper...?明天我來找找看，找不到
→ aggaci:再請教你~~