推 seal0413:感謝~~感謝~~^^ 05/10 13:04
※ 引述《seal0413 (seal)》之銘言：
: 請問酒精固定的細胞可以做annexin v和PI的雙染法嗎??????????
: 若有人可提供此實驗的protocol 更是感激不盡
剛看完Macross Frontier 6心情好v(￣︶￣)y
1. 前置細胞數 (條件可以自己抓)
10cm dish 10^5~10^6
6-well 2*10^5 per well
2. <<<<<你的實驗處理>>>>>>
Positive control一定要有 而且要一定會出現apoptosis的濃度...死成一片最好
3. Harvest cell with trypsin
(如果連已死亡漂浮的細胞也要看的話記得把wash的PBS也加進去離心)
4. Centrifuge 2000rpm at 4 centigrade for 5 min, remove supernant
5. PBS wash and draw out PBS
6. Rnise with 1X Binding buffer(250uL)
7. Centrifuge 2000rpm at 4 centigrade for 5 min, remove supernant
8. Resuspen with 200uL 1X Binding buffer
====重要步驟=====
把 Control 分成兩管 一管雙染 一管都不染
把 positive control分成三管 一管雙染 一管單染AV一管單染PI
分管理由-矯正機器(上機後的事)(Beckman機器 BD不清楚是否需要調校)
雙染Control調整到左下區域後
再分別換成單染AV看是否有落在正確象限
再換成單染PI看有沒有落在正確象限
再換成positive control的雙染看是否落在正確象限
最後換成不染的Control看剛剛調整的是否有跑掉
================
9. Add 5uL Annexin V(20ug/mL), 10uL PI(50ug/mL) (BD kit)
10.Incubation in dark for 15 min.
11.Add 1X binding buffer to 1000uL.
12.立刻上機 (所以第九步通常拿到機器那邊再操作)
心得:跑AV-PI最難的地方在調整.....
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nicht zu brechen...dann verspreche ich: ◣ ▍ ▁▃▄▅▄▃◥
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sogar jedes Haar auf meinem Kopf gehört dir. ◥ ‵▆▆▇
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