Re: [求救] TA cloning一直失敗.....

[reteporeh (颱風也喜歡放假)]

我也用過同家公司的TOPO TA cloning
我做過的話2.2kb都是一次就成功了
都是直接照公司來的protocol做
所以我想你的1.8kb應該是很好接上去的
切膠回收的話我想你的PCR濃度就會降低
而且A' overhang也很容易掉
不過產物比較純..可以排除掉一些非major的雜band
之後做ligation
transformation長出來的clone數明顯會比你直接用PCR的產物去做ligation的少
因為我之前也做過切膠回收跟直接做的
長出來的clone數真的差很多喔


我想你的問題很可能出在competent cell
因為我是用商品化的comptent cell
借其他人的comptent cell來做看看吧
或者借看看其他lab有沒有商品化的comptent cell做
因為我覺得competent cell做不好的話
會影響到你之後的transformation
我記得這組TA Cloning kit不便宜喔
相較之下用好ㄧ點的competent cell就很便宜了


※ 引述《owl628 (owl628)》之銘言：
: 我用的是invitrogen的TOPO TA Cloning
: 用Tag P出我的要的片段,約1800b.p
: 加4ul和1ul的salt solution及1ul的TA vector作用
: (22度西 30分鐘)
^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^這邊的話我是放室溫30分鐘
: 接著用自己做的competent cell(DH5α)做CaCl2 transformation
: 結果做了快10盤,不是沒長,就是長的colony抽不出質體
: (養的時候感覺菌液就不是很正常,有點稀)
: 抗生素Ampicillin及Kanamycin都用過了
: 不知道有沒有人可以給我個建議,麻煩大家了
: 謝謝~

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※ 編輯: reteporeh       來自: 61.227.129.79        (06/08 14:00)
推 rivis:Taq有proofreading嗎？有的話就不會有A
推 owl628:Tag沒有,pfu才有.
推 owl628:請問一下你的PCR產物是直接做ligation嗎???連PCR clean up
→ owl628:都沒做嗎???謝謝~
推 yaliu:沒clean up出來的clone會很難挑吧...因為dNTP還蠻過量的
→ reteporeh:恩..沒做..就直接ligation..fresh PCR product只取1ul
→ reteporeh:補充一點.我PCR的產物很專一..所以才敢沒做回收就直接做