推 rickson:我也有遇過類似的事情 最後是從SATELLITE小COLONY中挑到 06/12 23:58
推 leftt:也碰過類似的 最後是作colony hybridization挑到的 7/4000 06/13 10:18
推 owl628:謝謝大家~ 06/13 13:20
※ 引述《owl628 (owl628)》之銘言：
: 我用的是invitrogen的TOPO TA Cloning
: 用Tag P出我的要的片段,約1800b.p
: 加4ul和1ul的salt solution及1ul的TA vector作用
: (22度西 30分鐘)
: 接著用自己做的competent cell(DH5α)做CaCl2 transformation
: 結果做了快10盤,不是沒長,就是長的colony抽不出質體
: (養的時候感覺菌液就不是很正常,有點稀)
: 抗生素Ampicillin及Kanamycin都用過了
: 不知道有沒有人可以給我個建議,麻煩大家了
: 謝謝~
分享我個人的經驗。
我曾經做過一個TA cloning，一個月都做不出來。當時想怎麼可能？TA cloning從大學
做到碩士畢業，沒有上百也有數十次，只有colony的多寡，不可能會完全做不出來。
我當時遇到的情形是，比例調得再完美，再細心，就是沒有白色的colony，就算是藍色的
也很少。
這時候可能會覺得是transformation的問題或者是ligation的問題。
很不幸的我做了一個control，只有放vector加ligase去self ligation。實驗組就是
有加insert。結果是control組長滿了藍色的colony，實驗組只剩10顆藍色colony，白色
的只有1顆，抽出來check的結果也不是我要的大小。
為什麼呢？因為我放進去的fragment E.coli不喜歡。我猜你的東西八成是病毒的基因
或者是某個很重要的transmembrane protein才會遇到這種情形。
我的建議是，如果只是要用來送進mammalian cell表現，那你可以在你的fragment中間
加一個intron。也就是分成三步驟: 1. N terminal 2. intron 3. C terminal。
這種情形下以我朋友的經驗就可以做得出來了。
如果你是要用來純化protein.. 那你可能要考慮用yeast或者細胞去表現你的protein了。
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