[求救] p-Akt

[lorna184 (小宛)]

> <....我的p-Akt一直跑不出來...

希望版上的大大可以提供一下寶貴的意見 > <

小妹原本用cell signal的p-Akt,但是壓出來片子超乾淨的說
後來再try幾次,它終於有一點點出現(真的只是一點點),還壓了一個多小時
以為抗體有問題,所以就try它們的positive control是有成功的
所以想說會不會因為所有的東西都是for它們的,所以買了abcam的抗體來try
結果........是一樣的,所以抗體方面是沒問題的,但一點疑惑就是,
兩種抗體都是for human 和 mouse,我們用相同的條件做老鼠和人類
老鼠的band超明顯,但是人類就不行了,接著就開始尋找問題,
想說會不會是milk或是BSA的濃度太高,以至於把membrane的空缺都給補滿了,
所以抗體才抓不上去,原本用 5%安佳blocking 1hr,一抗(1:1000)in 5%BSA 4℃ overnight
,二抗(1:1000)in 5%安佳 RT 1hr

後來嘗試 3%安佳blocking 30 min 或不blocking,一抗in 1% or 5%BSA RT 2hr,
二抗都是in 5%安佳,而BSA也用過sigma兩種不同cat.來try,結果.....................
.........都是一樣的.......壓了一個多小時.......有加刺激劑的都超淡淡淡淡淡淡

不知道版上的各位..> <...可以提供小妹其它的做法....感激不盡!!!!!!!

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 163.25.108.117
推 lail:1抗濃度增加,再不行就試看看2抗o/n(濃度不變),參考參考囉^^
推 konlon:用用MILLIPORE的ECL市試試看
推 tsubasawolfy:protein怎麼收的?
推 adagoddess:一抗 (1:500) over night,隔天回溫久一點(2hr)
→ adagoddess:Wash時間次數減少，二抗上久一點(2hr)。試試看吧
推 liuse:你load多少protein   太少不行的  cell-type也有差
→ liuse:cell signalling賣的很好用阿  我們這邊也常用
推 icome:我做LNCaP pAkt也是超級弱 後來火大把1抗用到1:200就出現了
→ lorna184:1:200.....@@"......我先去試試大加的意見看看...多謝!!