推 liuse:原PO用這細胞 好詭異 這麼弱喔 07/06 16:33
→ sktzy:!_! 07/06 16:34
你的磷酸化位置是哪裡？
T308本來就不好做loading的量幾乎都一定要大於100ug
S473我都是loading 50-70ug 這樣才可以每次都有訊號
當然不同細胞表現量不同 你可以多試試!
※ 引述《crement (cometoseeme)》之銘言：
: 試試看Pierce的ECL NANO or Pico
: 不同細胞本來就不能比阿，表現量很可能不同，
: 多一點protein，換high sensitive ECL，
: 壓片久一點，
: 然後去買好一點的X FILE，
: 加油吧！
: ※ 引述《lorna184 (小宛)》之銘言：
: : 希望版上的大大可以提供一下寶貴的意見 > <
: : 小妹原本用cell signal的p-Akt,但是壓出來片子超乾淨的說
: : 後來再try幾次,它終於有一點點出現(真的只是一點點),還壓了一個多小時
: : 以為抗體有問題,所以就try它們的positive control是有成功的
: : 所以想說會不會因為所有的東西都是for它們的,所以買了abcam的抗體來try
: : 結果........是一樣的,所以抗體方面是沒問題的,但一點疑惑就是,
: : 兩種抗體都是for human 和 mouse,我們用相同的條件做老鼠和人類
: : 老鼠的band超明顯,但是人類就不行了,接著就開始尋找問題,
: : 想說會不會是milk或是BSA的濃度太高,以至於把membrane的空缺都給補滿了,
: : 所以抗體才抓不上去,原本用 5%安佳blocking 1hr,一抗(1:1000)in 5%BSA 4℃ overnight
: : ,二抗(1:1000)in 5%安佳 RT 1hr
: : 後來嘗試 3%安佳blocking 30 min 或不blocking,一抗in 1% or 5%BSA RT 2hr,
: : 二抗都是in 5%安佳,而BSA也用過sigma兩種不同cat.來try,結果.....................
: : .........都是一樣的.......壓了一個多小時.......有加刺激劑的都超淡淡淡淡淡淡
: : 不知道版上的各位..> <...可以提供小妹其它的做法....感激不盡!!!!!!!
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