作者lazyQ (認真過每一天)
看板Biotech
標題[求救] primer anneal
時間Thu Aug 14 15:31:45 2008
需要做一個cloning，使用2個primer 去anneal出我要的基因(這個
基因很短)，為了方便ligation，2個primer各有一個cuting site。
primer A: Tm:73.5℃
5' 3'
TTAAGCTTAGAAGGAGAACCATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCT
------ ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^
HindIII overlap
primer B: Tm:75.8℃
5' 3'
AAGGATCCTCTCCGGTGGTATCTGGGAGCCAGAGTAGCAGGAGGAAGAGAAGCTG
------ ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^
BamHI overlap
overlap:是我要anneal出來的基因片段
請問我要怎麼樣才能成功的anneal這兩個primer？
並且可以在agarose gel看到清楚的band呢？
目前都只能看到一團糊糊的，不像正常的DNA電泳跑出來的清晰的band
試過1.68~55℃的anneal溫度
2.加過2%~10%的DMSO
3.直接拿糊糊的那團去做後續的步驟，可是長不出colony @@~
我想要詳細的protocol，謝謝。
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 134.208.24.2
推 Fourfish:有先加熱denature嗎？(好像72度還是更高忘了= =") 08/14 16:01
→ Fourfish:另外vector怎麼處理的？去磷酸嗎？ 08/14 16:03
→ lazyQ:有先加熱95度denture 5mins 08/14 21:09
推 sGoat:你都作這麼長的primer了,不考慮直接合成一條就好? 08/14 23:35
推 MacBook:可以參考site direct mutagenesis的protocol 08/15 20:25
→ MacBook:先把這兩組primer當template(各很少量~25ng) run 10cycles 08/15 20:26
→ MacBook:在把全長的5'和3'ter primer(另外設計)加入繼續run15cycle 08/15 20:28
→ MacBook:但這是很笨的做法....你都已經設計這麼長了... 08/15 20:28
→ MacBook:既然基因不長我建議你訂購全長的序列正和反股 08/15 20:33
→ MacBook:然後把他anneal起來..孤一下oligonucleotide annealing 08/15 20:33
→ MacBook:就會找到很多protocol了 08/15 20:34