[求救] Plamid 泡過 buffer在跑膠變成smear...

[mzac1b (Goodday)]

我用NEB的enzyme EcoRI 和 SpeI 做double digestion
切載體欲切下1KB (NEB buffer 2)
結果有切下預期的band
然而載體卻像是變成碎片, 原先約8k 的plasmid 變成200bp~ 5k 的smear

即使我換了NEB 的表, double digestion 建議使用的 NEB buffer EcoRI
仍然是一樣的結果

後來發現:

1. 把 DNA (來自mini prepare)
   泡在 1X Buffer EcoRI, 37度C, 1hr, 跑膠, DNA 就變成 smear
   (不加enzyme)

2. 如果 DNA 加水, 37度C, 1hr, 跑膠, 還是能看到能看到清楚的兩個band
   (看起來band 像比較正常的 plasmid supercoild 之band)

所以我猜測我使用的buffer 會使 plasmid 被切碎
總之DNA 爛爛的想挖膠都看不見明顯之band
或是預期之band 微弱, 取而代之的是smear 一大片

不知道有沒有人遇過類似的情況?
可能是什麼原因?
感謝任何建議或意見


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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 140.109.55.238
推 sGoat:你是vortex還是gentily mix反應液?
推 davideason:我覺得質體沒差,倒是該換別家lab的buffer來看看結果
推 huhu126:換新的10X buffer再切, buffer壞了吧
推 yaliu:vector的主體應該還見的到吧，我有時候切也會有這樣拖曳情形
→ yaliu:原因為何我不曉得，不過最近比較少了...建議不要切超過三個
→ yaliu:小時......
→ mzac1b:主體非常淡 甚至smear 比預期band 強很多