推 tsubasawolfy:不太喜歡做cloning原因就是...運氣ˊˋ 08/25 16:08
推 sisyphus:接一年實在是很難想像的事情 不過該作inactive還是作吧 08/25 16:24
→ lainhat:目前還在接其他的 所以我沒有一天停止cloning過 囧 08/25 16:29
推 sisyphus:要相信自己不是最慘的!!加油!!!!! 08/25 16:32
推 sGoat:=.= 你可能有些東西沒有搞懂,去問問有經驗或專門在做的人吧 08/25 16:57
→ sGoat:基本上你的兩個問題的答案都是不會,就我做的情形來說啦 08/25 16:58
→ sGoat:phenol/chloroform下去蛋白就失活了,kit膜也是黏DNA而已 08/25 16:59
所以sisyphus大大的cloning因為有做inactive所以都蠻順的嗎?
另外老闆有試過ligation完 讓ligase失活 的確會增加效率 雖然對我來講沒改變
(菌連一顆都沒有 無從比較效率問題= =)
最近是懷疑Kit回收的問題 因為據說前人都沒有困擾 都是用軟膠回收的
所以也可能是有經phenol/chloroform的關係inactive restrict enzyme影響?
到我進來以後大都用Kit硬膠回收 cloning從此一蹶不振 大家都一樣沒得挑
想知道各位大大的cloning順的過程 究竟和我的步驟有沒有差
畢竟已經要升研三了 這樣還蠻尷尬的處境
雖然我相信自己不是最慘的 但也應該算慘的那一群了T.T
麻煩有寶貴經驗的大大多指教...先感恩了
※ 編輯: lainhat 來自: 140.130.87.174 (08/25 18:03)
推 alaric:ligation累人, 有時很順, 有時快發瘋了.... 08/25 21:26
→ alaric:今年也很不順.. 都接不如預期的. 08/25 21:27
推 sisyphus:我不會跟你說因為我有inactive所以實驗順 但是我作實驗 08/25 21:36
→ sisyphus:的習慣是 我可以掌握的部份我作到最好 其他由實驗之神 08/25 21:37
→ sisyphus:決定 08/25 21:37
推 witchs:請問你的inser$vecor 大小分別是？transformation過程? 08/25 21:46
→ witchs:研三還滿慘低..加油！！ 08/25 21:47
→ witchs:加油！我剛開始也是接了半年，之後抓到訣竅後一星期就ok了 08/25 21:49
接好的我就不說了
目前正在接的(算是基因置換而已)
insert(PCR再陸續純化出來的) 約3.75Kb
-geneA-
/ \
SbfI+BamHI EcoRV+SacII
vector是從一個老闆以前的construct 切完約5.3Kb(去掉geneB)
ubiP-ubiI-geneB-nos-pBS
| |
PstI SacII
SbfI和PstI切位一樣 所以可算同一切位
聽說DNA長短對ligation也有好接不好接的問題?
先前做一年的也是算基因置換 其實家裡作法通常是留construct
再依construct去設計primer 話說研一我也是每天抱著愉快的心情去做
(那時剛開始電plasmid都長滿滿整盤 都覺得很簡單又順利)
直到接完電完隔天看到沒長菌就傻了 從此就抱著既期待更怕受傷害的心情過日子了 囧
現在要升研三了連要做的實驗分析都還沒進行 再這樣耗下去實在不行
希望有撇步的大大傳授一下 不管怎樣有試有希望
現在問題其實蠻多的 我的用ampicillin篩選 時間久了都會長衛星菌落
(雖然大部分是連菌都沒長)
同實驗室的也有改接kanamycin的vector去避免這種情況
而我已經置換好promoter了(原本不是UbiP) 外加vector內有我的基因切位
所以只好治標不治本 硬著頭皮用ampicillin篩選
不過有加強濃度到1.5倍的量 讓菌長大顆一點又不至於有衛星菌落
也有換新的菌去做competent cell(懷疑原本的菌有改變 變的有抗性?)
但還是沒有改變沒長菌的事實 培養基也改用更營養的SOC去recovery
總覺得...很慘阿!
關於witchs大大問的transformation過程
我是取ligation產物(1~3ul)去電
有看過大陸文章對XL1-Blue最佳轉型效率是2.5KV 200歐姆 25uF
有去試過
因為原本機器推薦的1380V 125歐姆 50uF都沒長菌很困擾(circular form的很多啦)
電前從冰箱拿出competent後置於冰上一段時間自然融化
(老闆是說用手溫快速融化較好 兩者都做過 結果一樣沒啥變好的跡象 囧)
之後菌和DNA混合後置於冰上一段時間(約5' 最近這樣 以前沒在等的)去電
電完後用1ml LB 小心沖吸菌至養菌管 37度C shake約30'~60'
(有聽說電完直接沖吸 老闆說要等約5'~10' 讓DNA跑進菌裡 都試過 結果一樣慘)
當然更先前因為電都沒長single colony 所以有改用heat shock的方式做transform
這邊我也想問一個問題=o=P
就是heat shock通常是一管eppendorf將DNA加入去做吧
那各位大大會用eppendorf直接去搖 還是 吸至養菌管去搖?
我用eppendorf養感覺底部管壁都有沉澱物 總覺得很怪
有想到跟溶氧量是否有關係 有看精華區好像有說無氧呼吸菌容易長怪東西?
跟學弟討論 他是覺得短時間(30'~60')應該沒差
大概就是這樣了 歡迎指教
※ 編輯: lainhat 來自: 140.130.87.174 (08/26 05:41)
推 sGoat:那是細菌不是沉澱物阿~~~ 08/26 08:21
推 tsubasawolfy:competent cell不能用手摸 囧 08/26 08:35
推 sGoat:可以啦,只是回溫太快會影響效率,建議原PO每步都做control 08/26 08:38
→ sGoat:試過一次就知道是哪裡出問題 08/26 08:38
推 sGoat:在你的每一個步驟都以空vector做相同的實驗作為對照 08/26 08:52
→ sGoat:太長的plasmid會有長出來的菌較小的情形,養16小時還是可以挑 08/26 08:54
推 sGoat:amp濃度為100μg/ml,最多讓你養16hr就會長雜菌,太久都不要用 08/26 08:59
→ sGoat:還有看一下切完剪接是不是需要做去磷酸化的步驟 08/26 09:00
→ lainhat:感謝大大的熱心建議^^ 08/26 17:19