[求救] 有關EMSA的問題

[sdshow (蝶)]

想請問一下

我們LAB想看CENP-B跟HeLa cell的核蛋白有無interaction
之前好像有clone CENP-B的片段，然後transfection送到HeLa cell中
從fish的data上看，似乎是有interaction，想在利用gel shift 佐證

老師告訴我的方法，就是抽HeLa的核蛋白，然後把之前transfection的clone dna跟
核蛋白作用，然後跑1% agarose gel，在用EtBr染色，如果蛋白跟dna有interaction
就會shift上去。

發現出來的DATA，整個lane是smear, 如果是DNA only或是protein only的lane則不會
看到smear的現像，
這樣的data是表示 protein跟dna有interaction嗎??

請問一下，這樣的方法可行嗎
看paper都是跑acrylamide gel，dna也有經過biotin或放射線lable，
我們的這個方法，有沒有問題呀~~~~




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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.128.65.234
推 tsubasawolfy:EMSA不是還要用Ab確認蛋白- -?
※ 編輯: sdshow          來自: 140.128.65.234       (09/03 13:49)
→ sdshow:我這個應該不用吧，我是知道有人在DNA上lable biotin，然後
→ sdshow:用HRP呈色看結果，沒用到Ab耶
推 sGoat:這應該算是gel shift的結果了吧,因為你並不知道他會怎樣與
→ sGoat:DNA纏繞,所以只能知道有shift,而不一定是較高或是較低的band
→ sGoat:記得要附上DNA only與 protein only的圖
→ sGoat:不過你要不要拿不會binding的DNA與你的核蛋白作用跑跑看?
推 blence:實驗沒有postive con.的話,說這smear現象為shift是會被釘的
→ blence:此外若沒有排除核內nuclease干擾我會推測smear是被切碎造成
推 milkpa:記得要有一個DNA+BSA的negative control，另外，如果蛋白
→ milkpa:質夠多的話，多加一點應該結果會更漂亮（如果可以逼近飽和
→ milkpa:smear通常是DNA跟蛋白質binding的位置不只一個所造成，當然
→ milkpa:這便暫時先不考慮樓上b網友所說nuclease的作用，如果使用
→ milkpa:oligo nucleotide進行EMSA，多半都只會有一個shift的片段
→ sneak: 用HRP呈色看結果，沒 https://muxiv.com
→ sneak: oligo nucle https://muxiv.com