推 vancent:ㄎㄎ~最近正在用AMAXA的~TRY個CONDITION就要一萬五XD 09/04 18:10
推 aceliang:之前有用勁因代理的Microporator，蠻不錯的。 09/05 00:01
推 skali:謝謝分享!construct之前已在HEK試過,沒問題,CMV promoter! 09/05 04:33
→ skali:看來electroporation應該是最佳選擇,不曉得calaium方法如何? 09/05 04:35
※ 引述《skali (德意志冒險中)》之銘言：
: construct 約 10kb
: 試了很多方法轉到neuronal cells
: PC12, SHSY5Y, primary neuron
: reagent試過 Lipofectamine 2000, fugene6, lipofectamine LTX
: 效率都極低或根本0
: (同時都有轉GFP當control,效率都超過50%以上)
: 請問是因為質粒太大的關係嗎?
: 還有什麼方法解決呢??
: 謝謝!
基本上如果是primary culture cell
用Lipo Fugene等化學方法，效率都無法很好
有板友提到用諾貝爾的electroporation Kit (我想應該是Amaxa的那組吧)
很貴，電一次要1000NTD左右，而且儀器也要你借得到。
不過你連Cell line的transfection都作不太出來的話
我覺得很可能是你的construct本身的問題，因為GFP會亮
如果可以的話，你可以再用HEK-293t這株cell line 試試看，這株超容易transfect
construct太大有可能造成plasmid較不易進入細胞核，這時候用electroporation
或是Gene Gun可能比較有效
除了太大之外，你也可以檢查你的vector的promoter，是否適合在哺乳動物表現(eg.CMV)
或是有無Tet-on/off的機制，vector是否年代久遠，裡面有產生奇怪的突變
再來plasmid的純度據說也都會影響transfection的效率。
參考看看
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