推 zoom8080:第3點:就算一班PCR跑膠看起來沒雜band，但也許有看不見 09/17 11:39
→ zoom8080:的產物，所以還是以上機為主，不過連跑膠都有雜band，那 09/17 11:40
→ zoom8080:當然primer是不能用的 09/17 11:41
推 soom:第二點：一般是樣本跟標準品會同時上機 選擇同一個threshold 09/17 11:47
想跟大家討論一下~
1.一般在做絕對定量時要做標準曲線也就是說一開始上機時你的DNA/RNA的量就要很準,
而且quality一定要很穩..或者是說每次做RT-PCR時一定要固定用某家的KIT去抽
DNA/RNA而標準曲線用的DNA/RNA也一定要用這一家的KIT..如此一來才不用因為quality
的關係影響到PCR過程..甚至連將RNA轉DNA的RT KIT也要固定用同一家..是這樣嗎?甚至同一個
LOT的KIT更好..(因為就算同一家的KIT..不同LOT的quality也一定會不一樣)
那大家是如何確定這一點呢?
2.我覺得在做PCR時template的量也會影響PCR的過程..那假設在建立標準曲線時..所選
擇的threshold假設是X好了..等建立好標準曲線..sample要上機了..那這時候的
threshold 還是要選擇X嗎?還是依機器給的建議選擇X1..這樣連threshold 都不一樣
可以做比較然後算出絕對量嗎?還是說要做絕對定量時除了sample要上機..連要建立絕
對量用的DNA/RNA也要一起上機..然後選擇一樣threshold..但是我覺得一開始template
的量如果不一樣..對PCR的效能也會影響其CT值..所以threshold因該也會不一樣吧?
3.選擇SYBR或Taqman的方式做real time結果一定要只有一個peak..(除了SYBP對Primers
的影響)..所以大家會先去做一般的PCR看有沒有雜band..是這樣嗎?
抱歉..因為我沒做過RT PCR..只是單純好奇..從網路上邊學邊看的..
希望大家可以為小弟解答一下..^^
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