推 flywind1209:謝謝A大詳細的解說 所以兩股都要考慮進去囉^^ 09/28 02:12
→ flywind1209:還少了一個很重要的實驗喔>> ChIP 09/28 02:12
推 HIbaby:幫轉 biotech 09/28 19:23
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◆ From: 133.11.198.91
推 hajimels:推一個~ 09/29 13:16
→ hajimels:推原作者及轉過來的HIbaby 09/29 13:17
※ [本文轉錄自 PhD 看板]
作者: alexflybaal (Evanescance) 站內: PhD
標題: Re: [問題] promoter 分析問題
時間: Sun Sep 28 02:10:13 2008
※ 引述《flywind1209 (飛翔風~)》之銘言：
: 想請教做 gene regulation 的專家,在分析promoter時,除了要考慮到sense DNA
: 也要考慮antisense strand DNA sequence 嗎? (假設X gene位於 sense strand DNA)
: 接著問,假設調控X基因的 transcription factor有6個,會發生下列情形嗎
: 其中4個在 sense 剩下2個在 anti-sense,也就是分布在不同的strand DNA上...
: 因為沒遇過,也不曉的實際情形是怎樣,請專業的朋友來解答囉,感激不盡!
我分享一下我的經驗
當你clone到你的promoter後
你應該會用GCG或是像TESS的網站收尋你的調控位置
也有可能藉由其他的paper所提供transcription factor binding site的序列
利用一些像DNA star或是VectroNTI或是workbench等
畫出可能的transciption factor binding site的分佈
這個部份一定會出現sense以及antisense的分佈
不過這是正常的
你應該要搞清楚的是 你現在是進行的cis regulation的研究
實際上妳要驗證promoter上哪個部分是調控的部份
可以進行幾個實驗
footprinting -- 可以找出promoter上哪些部份會與transcription factor
結合, 做出分佈, 這個實驗不好作, 有時候結果不好看出
Dual leuciferase assay -- 這個是promega的kit, 不過還蠻昂貴的, 需要
冷光儀, vector自己買, transfection reagent
自己買, 還要避免用到不適合的cell line
上面二選一即可
EMSA -- 當你找到某個promoter區域可能跟某些transcription factor結合
妳可以利用這個實驗, 驗證某個transcription factor會與你所找到
的區域結合
再來就是一些transcription factor活化, 基因表現的實驗
介紹一本不錯的書
Methods in molecular biology v.130
Transcription factor protocols / edited by Martin J. Tymms.
裡面應該會有你所有會進行promoter研究的實驗方法和概念
那麼就預祝實驗順利囉
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