※ 引述《HIbaby (燃燒吧! 嗨~北鼻!)》之銘言：
: 標題: Re: [問題] promoter 分析問題
: 時間: Sun Sep 28 19:23:51 2008
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: ※ [本文轉錄自 PhD 看板]
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: 作者: alexflybaal (Evanescance) 站內: PhD
: 標題: Re: [問題] promoter 分析問題
: 時間: Sun Sep 28 02:10:13 2008
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: ※ 引述《flywind1209 (飛翔風~)》之銘言：
: : 想請教做 gene regulation 的專家,在分析promoter時,除了要考慮到sense DNA
: : 也要考慮antisense strand DNA sequence 嗎? (假設X gene位於 sense strand DNA)
: : 接著問,假設調控X基因的 transcription factor有6個,會發生下列情形嗎
: : 其中4個在 sense 剩下2個在 anti-sense,也就是分布在不同的strand DNA上...
: : 因為沒遇過,也不曉的實際情形是怎樣,請專業的朋友來解答囉,感激不盡!
:
: 我分享一下我的經驗
:
: 當你clone到你的promoter後
:
: 你應該會用GCG或是像TESS的網站收尋你的調控位置
:
: 也有可能藉由其他的paper所提供transcription factor binding site的序列
:
: 利用一些像DNA star或是VectroNTI或是workbench等
:
: 畫出可能的transciption factor binding site的分佈
:
: 這個部份一定會出現sense以及antisense的分佈
:
: 不過這是正常的
:
: 你應該要搞清楚的是 你現在是進行的cis regulation的研究
:
: 實際上妳要驗證promoter上哪個部分是調控的部份
:
: 可以進行幾個實驗
:
: footprinting -- 可以找出promoter上哪些部份會與transcription factor
: 結合, 做出分佈, 這個實驗不好作, 有時候結果不好看出
:
: Dual leuciferase assay -- 這個是promega的kit, 不過還蠻昂貴的, 需要
: 冷光儀, vector自己買, transfection reagent
: 自己買, 還要避免用到不適合的cell line
:
: 上面二選一即可
:
: EMSA -- 當你找到某個promoter區域可能跟某些transcription factor結合
: 妳可以利用這個實驗, 驗證某個transcription factor會與你所找到
: 的區域結合
:
: 再來就是一些transcription factor活化, 基因表現的實驗
:
: 介紹一本不錯的書
:
: Methods in molecular biology v.130
: Transcription factor protocols / edited by Martin J. Tymms.
:
: 裡面應該會有你所有會進行promoter研究的實驗方法和概念
:
: 那麼就預祝實驗順利囉
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以上A大說法有幾個盲點存在:
1.除了cis-regulation 外,trans-regulation也挺常見的呢!
2.footprinting和EMSA都屬於探討promoter序列是否有transcription factor binding
這兩種方法才是二選一吧？不然本錢夠雄厚的話,拿去用MS打一打也可以知道啦~
3.luciferase activity assay 只是ㄧ種測試promoter是否具有活性的方法，
並無法證實factors會與序列binding,
luciferase 也只當作reporter gene得一種選擇罷了，
reporter gene百百種，B-galactoside, CAT, 或是其他也很常用，
為什麼要選一個連帶硬體設備都要一起買的kit呢?
陽春單管luciferase偵測儀要近20萬,多管的動輒上百萬,
你們實驗室很有錢嗎?
另外,A大介紹的書還真的不錯,可惜對於日新月異的技術發展而言,2000出版的內容稍嫌舊了點,
原理沒有問題,不過真要運用做分析,有很多方法都要再改良吧.
以上,小建言.
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: 推 flywind1209:謝謝A大詳細的解說 所以兩股都要考慮進去囉^^ 09/28 02:12
: → flywind1209:還少了一個很重要的實驗喔>> ChIP 09/28 02:12
: 推 HIbaby:幫轉 biotech 09/28 19:23
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