※ 引述《e2653495 (melanogaster)》之銘言：
: ※ 引述《HIbaby (燃燒吧! 嗨~北鼻!)》之銘言：
: : 標題: Re: [問題] promoter 分析問題
: : 時間: Sun Sep 28 19:23:51 2008
: : 作者: alexflybaal (Evanescance) 站內: PhD
: : 標題: Re: [問題] promoter 分析問題
: : 時間: Sun Sep 28 02:10:13 2008
: : 我分享一下我的經驗
: : 當你clone到你的promoter後
: : 你應該會用GCG或是像TESS的網站收尋你的調控位置
: : 也有可能藉由其他的paper所提供transcription factor binding site的序列
: : 利用一些像DNA star或是VectroNTI或是workbench等
: : 畫出可能的transciption factor binding site的分佈
: : 這個部份一定會出現sense以及antisense的分佈
: : 不過這是正常的
: : 你應該要搞清楚的是 你現在是進行的cis regulation的研究
: : 實際上妳要驗證promoter上哪個部分是調控的部份
: : 可以進行幾個實驗
: : footprinting -- 可以找出promoter上哪些部份會與transcription factor
: : 結合, 做出分佈, 這個實驗不好作, 有時候結果不好看出
: : Dual leuciferase assay -- 這個是promega的kit, 不過還蠻昂貴的, 需要
: : 冷光儀, vector自己買, transfection reagent
: : 自己買, 還要避免用到不適合的cell line
: : 上面二選一即可
: : EMSA -- 當你找到某個promoter區域可能跟某些transcription factor結合
: : 妳可以利用這個實驗, 驗證某個transcription factor會與你所找到
: : 的區域結合
: : 再來就是一些transcription factor活化, 基因表現的實驗
: : 介紹一本不錯的書
: : Methods in molecular biology v.130
: : Transcription factor protocols / edited by Martin J. Tymms.
: : 裡面應該會有你所有會進行promoter研究的實驗方法和概念
: : 那麼就預祝實驗順利囉
: ------------------------------------
: 以上A大說法有幾個盲點存在:
: 1.除了cis-regulation 外,trans-regulation也挺常見的呢!
: 2.footprinting和EMSA都屬於探討promoter序列是否有transcription factor binding
: 這兩種方法才是二選一吧？不然本錢夠雄厚的話,拿去用MS打一打也可以知道啦~
我個人不覺得是2選一
通常是footprinting做完再作EMSA
footprinting目的在於大片段(300bp~100bp)地去尋找哪些區域有protein結合在哪邊
如果鎖定哪些區域的話(這時候長度約50bp-15bp之間)
再用EMSA去找是哪種蛋白質結合在上面
不過footprinting非常難作，能避就避
footprinting是我唯二做過一次後就不想再碰的實驗
另一個是2D...顆顆
: 3.luciferase activity assay 只是ㄧ種測試promoter是否具有活性的方法，
: 並無法證實factors會與序列binding,
: luciferase 也只當作reporter gene得一種選擇罷了，
: reporter gene百百種，B-galactoside, CAT, 或是其他也很常用，
: 為什麼要選一個連帶硬體設備都要一起買的kit呢?
: 陽春單管luciferase偵測儀要近20萬,多管的動輒上百萬,
: 你們實驗室很有錢嗎?
: 另外,A大介紹的書還真的不錯,可惜對於日新月異的技術發展而言,2000出版的內容稍嫌舊了點,
: 原理沒有問題,不過真要運用做分析,有很多方法都要再改良吧.
: 以上,小建言.
: : --
: : ◆ From: 118.160.137.199
: : 推 flywind1209:謝謝A大詳細的解說 所以兩股都要考慮進去囉^^ 09/28 02:12
: : → flywind1209:還少了一個很重要的實驗喔>> ChIP 09/28 02:12
: : 推 HIbaby:幫轉 biotech 09/28 19:23
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: : ◆ From: 133.11.198.91
: : 推 hajimels:推一個~ 09/29 13:16
: : → hajimels:推原作者及轉過來的HIbaby 09/29 13:17
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