[求救] cloning做好多次,表現蛋白一直不對

[genius012 (過了1/2個大學生活...)]

cloning 已經做好多次了,表現蛋白都很奇怪,想請問一下各位大大
我的insert大概是900bp ,primer上有Hind III和Bgl II的切位
我PCR後跑膠的位置是正確的
我的vector大約為4200bp左右主要是之前學長做過的
上有pEGFP,用來表現有螢光的蛋白
也用HindIII和BglII(是一起切的)
跑膠後位置也是正確的,切膠純化後(insert和vector的濃度為1ug/ml)
ligation做兩組(用T4 DNA ligase--->16度C overnight)
用1:1和1:2(想說兩者濃度相當接近,加上分子量關係)--->不知道是否比例不對
1:1-->總體積是25ul, 1:2總體積是35ul(ligase都加0.5ul)
transformation 後兩個比例都有長(正控有長)
但是奇怪的出現--->有兩種菌長出(一種有表現但較淡,另一種相當綠)
拿去做蛋白誘導後,(主要是希望誘導出insert接上EGFP蛋白)
較綠的菌表現的蛋白相當接近EGFP蛋白的分子 量(29kD)
另一個綠色顏色較淡表現的蛋白竟然相近原來做vector的plasmid(pEGFP-N230)
都沒有預期的蛋白分子 量
這樣是表示切膠沒切好嗎?  ligation效率很差?
可是做很多次,蛋白表現都怪怪的...好詭異
拜托了

在transformation後的兩個表現的菌種,有去抽其質體DNA,
並用HindIII和BglII切過
綠色螢光蛋白較強的跑出的DNA經限制每作用後有大概在4000bp左右
且是兩個微弱的band,
但另一個綠螢光蛋白表現較弱的經限制每作用後跑的位置與當初plasmid用限制每
切過後的兩個band差不多(4000bp與700bp附近)
因為學長希望再確認一些再拿去定序,
目前是專題生...


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◆ From: 59.127.205.99
推 huhu126:難道不能在誘導前先check你的clone是否正確,無法定序的話,
→ huhu126:至少做個PCR check transformation之後的colony再去誘導吧
※ 編輯: genius012       來自: 59.127.205.99        (10/05 02:22)
推 blence:如果上述流程都對,而強綠的size也無誤,由於GFP在N,請確認它
推 blence:in-frame沒問題,另外弱綠size不對的話代表vector沒切好,調
→ blence:整RE或另加CIP解決(以上假定你的RE site數,位置無誤)
→ genius012:請問CIP是甚麼?  沒有加過....
推 Crow22312:Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)