推 iamrim:你要表現的protein有帶tag嗎?? 10/06 00:19
→ nidus:有 一組是flag 一組是EGFP 10/06 01:17
推 ckshmin:如果細胞黴漿菌汙染效率會很差唷!!要不要試試重解細胞~~ 10/06 21:57
※ [本文轉錄自 Biology 看板]
作者: nidus (咕嘰) 看板: Biology
標題: <求救>lipofectamine 效率
時間: Sun Oct 5 22:49:17 2008
請問有人用過嗎？？
我做了好幾次效率低到看不到想要表現的protein
我的步驟如下：
genaid抽plasmid 再以酒精沈澱進一步純化
使用細胞為hela
transfect 前一天在六公分盤種9X10五次方細胞
第二天取500λserum free DMEM 與 3μg plasmid混和
20λlipofectamine與500λserum free DMEM混和 等五分鐘
將上述兩溶液混和 等20分鐘
將混合液倒入昨天seeding好的HeLa cell 六公分盤中
HeLa cell 六公分盤會先以PBS wash兩次 以將serum洗掉
六小時候再將medium置換成有serum的DMEM
24小時候收細胞 western檢測
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plasmid有提高至8μg 結果還是一樣
plasmid也有digest後跑膠 位置也對
只不過我欲表現的protein 並不是一個完整的protein
完整序列有276aa 而我只有取1~120
請問有沒有可能是無法folding而被進一步degrate掉？？
以上希望有大大相助 任何建議都好
謝謝
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