Re: <求救>lipofectamine 效率

[tinapig (提那豬)]

※ 引述《nidus (咕嘰)》之銘言：
: ※ [本文轉錄自 Biology 看板]
: 作者: nidus (咕嘰) 看板: Biology
: 標題: <求救>lipofectamine 效率
: 時間: Sun Oct  5 22:49:17 2008
: 請問有人用過嗎？？
: 我做了好幾次效率低到看不到想要表現的protein
: 我的步驟如下：
: genaid抽plasmid  再以酒精沈澱進一步純化

我之前是不需要用到酒精鹽沈澱,抽完的產物基本上就ok

: 使用細胞為hela
(我是用RD細胞)

: transfect 前一天在六公分盤種9X10五次方細胞
: 第二天取500λserum free DMEM 與 3μg plasmid混和
: 20λlipofectamine與500λserum free DMEM混和  等五分鐘
: 將上述兩溶液混和 等20分鐘
: 將混合液倒入昨天seeding好的HeLa cell 六公分盤中
: HeLa cell 六公分盤會先以PBS wash兩次  以將serum洗掉
: 六小時候再將medium置換成有serum的DMEM
: 24小時候收細胞  western檢測
: -------------------------------------------------------------------
: plasmid有提高至8μg  結果還是一樣
: plasmid也有digest後跑膠  位置也對
請問有確認過sequence嗎？
確認您的start codon跟fusion protein跟您的tag有in frame?

: 只不過我欲表現的protein 並不是一個完整的protein
: 完整序列有276aa  而我只有取1~120
: 請問有沒有可能是無法folding而被進一步degrate掉？？

我覺得有可能,因為我遇過類似的狀況
某protein的一系列deletional mutation
就有一兩個是幾乎不表現(band很弱)
當時有學長建議我用MG132之類的protein degradation inhibitor

後來真的有增加產量
(但也沒有正常表現的多)

若您實驗室有現成的protease inhibitor -->抱歉我是指"proteasome inhibitor"
也許可以試試看

或者如果是怕transfection 效率不好
也許下次可以做一個postive control~
同時多做一組已確定可表現的construct
這樣也可以幫忙釐清是否transfection效率問題

不確定是否能幫到您～
以上


: 以上希望有大大相助   任何建議都好
: 謝謝

--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.128.140.89
※ 編輯: tinapig         來自: 140.128.140.89       (10/07 11:50)
推 nidus:其實我每次做都會加protease inhibitor(cocktial)....
抱歉我是指proteasome inhibitor 一類的藥(原文訂正處)
→ nidus:我也有一組positive Control  也都有大量表現出來....
→ nidus:因為目前我使用的這幾組deletional protein以前的學姐有表現
→ nidus:出來,所以我猜應該也都有in frame
→ nidus:找不到原因下...目前我是換一個cell line(HEK 293)來做做看
→ nidus:如果在做不出來...應該會sequencing那些plasmid吧>"<
恩嗯,也許sequencing會是最快最直接的方法
(可以先思考是否有可能菌的保存有沒有可能污染？拿錯？)
→ nidus:謝謝您熱心的建議^^
不客氣～希望您實驗順利囉^^
※ 編輯: tinapig         來自: 140.128.140.89       (10/08 17:23)