推 tsubasawolfy:refolding還要抓OOXX的條件 想到就頭皮發麻 10/09 19:56
→ zytase:是阿...所以可以用其他方法繞過refolding這步是最好了 orz 10/09 22:50
推 HOPEFIRE:要試refolding條件還不如去試換vector 10/10 00:00
※ 引述《charlielg (chi)》之銘言：
: 1.大腸桿菌是目前表現外源基因最常用的系統,然而大腸桿菌表現系統常遇到
: inclusion body的問題,他是一種不可溶物質,這裡所謂不可溶是指不可溶於水
: 還是不可溶於任何溶液?
Insoluble ->無法溶在lysis buffer裡,但可以用高濃度urea使其溶解.
: 2.inclusion body是因為構型摺疊不正確而使其變成一種不可溶物質,因而造成活
: 性不佳,那是否當inclusion body變成可溶性也就代表活性會提升呢?
其實refolding這個步驟,如果可以用其他方法表現,就用其他方法,要從refoldimg下手
做出有活性的蛋白,我覺得很困難,尤其一些分子大的.在refolding之後是否正確,
而且損耗也很多(會沉澱),都是個"?",如果可以選擇其他方法,就不要用E. coli表現,
太大且有太多Cys的蛋白質!!
: 3.利用大腸桿菌來表現真核基因時,所表現出來的蛋白質會跟native form會差很多
: 嗎?如果會,那為何在很多實驗中還是要利用此系統呢?除了此系統便宜培養容易
: 及了解較深入之外,有其他考慮因素嗎?
其實有時候只是表現片段蛋白E. coli就是個好選擇,又快又容易做.
用E coli大概就是快吧! 還有任何人都可以做,不像cell cultural還需要擔心操作不當,
出現其他問題.
但如果是整段蛋白,還是選擇有醣基化且可以幫助蛋白正確folding的系統較好.
: 4.此系統最常被用來表現哪一類的外來基因(哪一類的蛋白質)?
這個問題,不知道該怎麼回答 @@ 很多種蛋白都有在E coli表現的紀錄吧@@
目前做過幾種蛋白(human),如果是整段的蛋白整個要在E. coli裡表現且Soluble實在太難,
但如果只是做一小段,通常是可以成功表現且Soluble,通常在預測時disulfide bond太多就
不會嘗試用E. coli,直接做到Insect cell表現.
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