[討論] ligation

[lazyQ (認真過每一天)]

一般在做ligation時都是vector + insert 去進行反應
如果說現在我有2個insert，把vector + insert 1 +insert 2，加在一起
ligase有辦法成功的將這三者接成一個環狀的plasmid嗎？

(只是想知道這樣能否成功，不討論先接一個insert，再接另一個喔)
(不考慮in frame,cutting site...etc這些問題的話)

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不是我想偷懶啦XD
最近做了一個clone，裡面有insert 1和insert 2
下一步是搬到另外一個vector(兩端的cutting site是一樣的BstXI)
好死不死，insert 1和insert 2中間發生mutation，跑出一個BstXI
這下冏了，我無法用BstXI將 insert1 - insert2 整個搬出來。

原本的規畫
vector1: -------BstXI---insert1-----------insert2---BstXI----

mutation後的結果
vector1: -------BstXI---insert1---BstXI---insert2---BstXI----

這樣能理解嗎？  我講得好亂>__<~

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 134.208.24.2
※ 編輯: lazyQ           來自: 134.208.24.2         (11/07 10:08)
推 sisyphus:你知道 三架飛機撞在一起的機率有多大嗎
推 sGoat:你的東西是positional digestion就可以,TA的話注意正反接
→ sGoat:也不是不行,但是你要有大量rapid screen的心理準備(百來株吧
推 turtle24:不考慮cutting site的話會做到死吧...
推 sGoat:抱歉說錯,是directional digestion
推 micocat:我做過三個接點是不同cutting site的
→ micocat:還有二端不同cutting site 中間blunt end
→ micocat:老實說我覺的跟一般ligation沒什麼不同啊
→ micocat:vector切的夠乾淨的話 挑16顆就可以挑到很多個了
推 sGoat:抱歉我百來株是指都是TA的情形,用不同切點是快很多沒錯
推 bolly:為什麼我覺得你想偷懶
※ 編輯: lazyQ           來自: 134.208.24.2         (11/07 14:26)
推 sGoat:那個突變是你要的嗎?不然重新clone不就沒這個問題了?
推 stinky:其實推薦用PCR  phusion很難有mutation
推 bluecsky:等等..都mutation了這樣的gene你能用嗎?重新clone吧
→ bluecsky:phusion是真的滿強大的...
→ sneak: 為什麼我覺得你想偷懶 https://noxiv.com
→ sneak: 老實說我覺的跟一般li https://muxiv.com