作者theessential (...)
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標題[求救] 關於protein purification
時間Mon Jan 12 01:27:11 2009
先謝謝大家進來看我的問題~^^"
我想要純化出來的protein大小約52kD
induction後 也跑過PAGE確認想要的protein有被induced出來 並且在對的位置
是以French Press破菌
這個protein學姊之前有純化過
差別便在於後來後來在C端接了個tag
由於之前學姐所用的是denature的condition
所以我所使用要通column的buffer全部都含6M Urea
可是我在純化時卻沒有辦法elute到足量的protein
收集了破菌後的supernatant與通過column後相比較
發現protein幾乎沒有binding上去
SDS-PAGE上 elution的部份根本看不見...@@"
後來做了Western
發現elution部分有protein
但是和column流出的相較 真的是很少很少
這是我使用的binding buffer配方:
5mM Imidazole
0.5M NaCl
20mM Tris-HCl
6M Urea 調整pH至7.9 (按Novagen His-Bind Resin column protocol指示)
所使用的所有buffer都確定過pH值無誤
也曾純化過在同一個plasmid上一定會被E.coli(BL21 DE3)表現的蛋白
可以成功的純化出來
也有將plasmid送去sequence 也確定His tag及所要的protein存在
現在找不出來protein為何會無法binding到column上
總覺得5mM Imidazole已經很低了
還是說應該試一試不含imidazole的binding buffer呢?
(但是會怕non-specific binding...)
建議調pH值嗎? 該怎麼調比較恰當呢?
或著有其他的建議?
因為是新手 經驗不多
拜託大家幫忙了
謝謝大家!
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◆ From: 140.129.62.101
推 pupuwu:1. Ni-NTA resin是reuse的嗎?괠 01/12 09:50
→ pupuwu:若是，上次用畢是否有用高濃度imidazole(500 mM)洗乾淨? 01/12 09:51
→ pupuwu:我使用的denature condition參照qiagen 配方沒有imidazole 01/12 09:52
→ pupuwu:但是binding buf內有0~20 mM imidazole理論上會增加專一性 01/12 09:53
→ pupuwu:應該不至於會使蛋白無法binding 01/12 09:53
推 pupuwu:可以說一下你的菌量和resin的體積和wash條件嗎? 01/12 09:55
→ pupuwu:是否是超過column能力 所以flow through很多 01/12 09:56
→ pupuwu:或是wash就都洗掉了?? 01/12 09:56
推 liuse:我想到的是C端接的His-tag 有沒可能沒露出來 被埋起來了 01/12 11:15
→ liuse:所以Ni-resin抓不到 再確定實驗步驟都沒問題後 有可能是這樣 01/12 11:16
→ liuse:ㄟ 我搞笑了 你是denature condition 01/12 11:17
推 wcegg:有沒可能根本是his-tag fram shift !? 01/20 13:49
→ wcegg:frame ... 01/20 13:50