[求救] 要在target上接一個retriction site

[satantaco (笨蛋TACO)]

因為作clone的需要  所以我要在target序列的前面多加一個限制脢切位
我想到的作法是   因為模板是genomic DNA所以  我的forward primer可以設計成如以下
    ATG以後是target            5'-.....ACTTGG ACCGCT ATGGGGCC.....-3'

假設我要加進去的site為TAGGAA   primer=>acttgg TAGGAA atggggcc
如此做pcr把site接進去


那我想問的是  我是否可以先設計跟原始序列相同的primer把target先p出來
再用加了切位的primer做secondary PCR  如以下
target序列               5'-ATGGGGCC....-3'
forward primer=>      TAGGAAatggggcc....
這樣p是否能將切位加上去  或者不行  麻煩大大們解答一下

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 59.112.6.180
推 chvkimo:我的經驗是可以,但是應該可以直接就使用 新的primer去夾
→ chvkimo:genomic DNA 就好了
推 Ice9:用 acttggTAGGAAATGGGGGCC 這條夾就好了。PCR後純化可立刻切
推 J0HAN:同上兩位  為什麼要多此一舉呢？不是很懂你的用意
→ satantaco:因為個人另外想如果模板是cDNA的話  是否可以用第二種
→ satantaco:方法XD     感謝大家嚕
推 CWChang1221:你的第二條primer有5個mer和原始序列不同, 算多了, 分
→ CWChang1221:兩階段夾比較不會夾出太多的雜訊, 另外要用cDNA或者
→ CWChang1221:genomic DNA 要看你要夾的地方有沒有 intron 來決定