※ 引述《cattailizu (眼睛一瞇瞇)》之銘言：
: 對不起 問這個問題有點蠢
: 因為一直抽同學的血來做實驗 對他很不好意思
: 以下有幾個問題，希望有經驗的人可以幫忙回答一下
: 1.PBMC算是初代細胞嗎?
: 之前有去上過細胞培養的課裡
: 老師有說 有些初代細胞可以繼代個4-8代，甚至有的細胞可以到12代
: 不知道有沒有人養過PBMC繼代的 或者是有哪些方法可以讓他增生或是活久一點
: 假設用不含任何營養物質的RPMI-1640養的話
: 大約可以活多久呢?
PBMC算是primary cell
PBMC是由monocyte, lymphocyte組成
通常來說，在一般的環境下(RPMI-1640 10%FBS)培養下
monocyte(貼附在dish底部)可以活比較久，大約ㄧ兩個星期沒問題
lymphocyte(漂浮在medium中)存活時間比較短，可能只有一個星期左右
要讓PBMC增生的方法有很多
例如用 PHA 刺激lymphocyte活化
你就可以拿到大量增生的lymphocyte
不過這個方法已經讓lymphocyte〝活化〞了
可能要視您的實驗目的而有所斟酌
: 2.計數的問題
: 因為是抽同學的血 一個人大約10-14mL
: 可是用細球計數器總覺得不到2*10次方的細胞(/mL)
: 這樣的數目是合理的嗎?
這裡的〝計數〞有點問題
以正常人而言，1uL的全血中大約有4000-10000顆白血球
換句話說，濃度大約在 4 ~ 10 x 10^6/mL
monocyte約佔周邊血液白血球的10%左右
lymphocyte較多，大概佔30~40%
因此，假設您是拿 10 mL 的全血取PBMC(約佔白血球的50%)計數
應有 2~5 x 10^7個細胞
: 計數的時候 連小粒的細胞也要數嗎
: 我主要是數比較大顆的?這樣做法是不是不對阿
這個問題牽涉到血球的型態學
有時候會因為分離的技術不純熟、或是試劑、溫度的問題
導致分離的PBMC不夠純
這時候可能會參雜一些紅血球、血小板或是嗜中性白血球
前面兩種血球的大小明顯比較小，所以應該蠻好區分的
比較麻煩的是嗜中性白血球的混雜
建議你可以改用Turk染色法(染細胞核)
可以分出單核(PBMC)與多核(嗜中性白血球)的差異
可以幫助你更準確地計算PBMC
: 3.看paper裡有人會加10%的FBS在RPMI-1640裡去養(但也有人不加)
: 因為ELISA會因為血清的存在或是脂質會影響分析結果
: 所以目前不太趕加FBS 但是分析IL-4跟IFN-r結果都怪怪的
: 會是因為不加FBS把血球們餓死的原因嗎?
: 以上希望有經驗的大大給我點建議
: 謝謝你們
以不含FBS的medium培養lymphocyte
基本上就是在誘發 lymphocyte發生apoptosis (serum starvation)
如果只是短期應該還可以
要長期觀察或是培養就不建議了
以上是小弟的一點心得
可以請有經驗的版友幫忙指正，謝謝
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我不想在球場上當一個沒用的人
也許我真得不是很厲害
再練下去也只有這樣子...
可是.......我就是會認真地去練習
賭賭看明天會不會變強一點...
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