Re: [求救] 關於histone的western blot

[lenti (啄木鳥)]

※ 引述《stool (要死了)》之銘言：
: 最近想要用histone來當我實驗一部分的positive control
: 我是用whole cell lysate來跑western
: 然後用anti-histone的antibody去測 (anti-H3)
: 可是做了幾次都超乾淨什麼band都沒有
: (cell: 293T   lysate量大概是20ug/lane)
: 因為我之前沒有用過
: 想請問一下histone需要先做purification再測嗎?
: 我在想我測不到的原因是antibody的問題還是histone的量本來就很少
: 直接用cell lysate測不到
: (應該不會是western的問題因為我同時有其它sample都有signal)
: 謝謝


histone 是可以用whole cell lysate直接跑, 可以不用純化處理.

我有直接用cell lysate 做過, 而且我是WB, H3, Ac-H3, Ac-H4, H3K9me2,

modification量會比total histone的量更少, 所以你壓histone H3 是沒問題的.

可能是抗體的問題.

你可以把loading protein 加到 40 ug 試試.

要注意histone 的size 約 17 kDa 左右,

記得用 12% ~ 15% SDS-PAGE 去run.

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 140.112.125.66
推 qqqpig:請問哪家的抗體較好?
→ lenti:Upstate (進階); Cellsignaling (細胞科技/諾貝爾)
→ qqqpig:多謝!
推 stool:thanks!
推 humwang:signal 若是不強的話, 也許可以考慮用super signal ECL
→ humwang:2nd antibody可以換用Jackson, 這是我用過最好的2nd Ab
推 leoblack:推樓上~Jackson的Ab真的好用!!!
推 tsubasawolfy:Jackson的2Ab買一次可以用好久...