推 silentence:詳細解說 推一個~ 04/12 21:23
※ 引述《monkey9841 (cc)》之銘言：
: 想請問一下
: 1.我使用的transfer的膜是用PVDF膜(但我忘記廠牌了)
: 那麼PVDF膜有正反面之分嗎
沒有~
: 因為 有時Transfer完後 當膜乾掉時
: 有時看的到protein 有時看不到
: 印象中學長姐都說膜沒有正反面之分
: 還是我看到protein只是運氣好呢?
有時候protein量(ug)太少也會看不太清楚
或transfer失敗當然也看不到
所以也要先確認transfer有無成功
: 2.有時transfer完後 當膜乾掉時
: 可以很明顯看到膜上有一大片泡泡 使protein沒法tran過去
確定是氣泡嗎?
請問您是用什麼方法tran呢?(溼or半乾式)
我之前tran"半乾式"有遇到過部分糊掉的狀況
有一種說法是壓上蓋施力不均或是太用力壓
: 我也有用玻棒趕氣泡耶
: 我都是先放膠 再蓋膜上去 然後用玻棒滾一滾 再蓋濾紙 還是有氣泡耶><
: 想請問 那如果先放膜 再把膠蓋上去 再蓋濾紙然後用玻棒滾一滾 會比較好嗎?
我覺得應該是沒差
雖然我的習慣是先放膜->gel
但我每放一層都會蓋一些bfr,再蓋下一層
蓋膜或是膠都由左往右放
利用bfr以及放置方向把氣泡往旁邊帶掉
－極
╱ (gel)
╱
╴╱ →
﹏﹏﹏﹏﹏ (transfer bfr)
————— (membrane)
＋極
(3M paper在圖中忽略沒畫)
每層疊放時也會稍微看一下有沒有氣泡
特別是在蓋bfr後,氣泡會變得比較明顯
最後我也會趕氣泡(避免有沒看到的氣泡)
: 3. 如果要收磷酸化的protein 好像聽說新鮮的會比較好
: 那是最久可以放多久呢?
(這個我就沒做過了^^")
: 4. 大家在收蛋白後 是否會把細胞上清液分裝成數管
: 每跑一次 只要拿一管出來解凍製備當檢品就好
: 還是其實可以不用分裝呢?
如果測的不是很容易degrade的蛋白
在收完細胞上清液後我都先測完濃度
->加sample bfr稀釋整組樣品到固定濃度
->煮95度->冰-20度
之後可以反覆loading數次SDS-PAGE都還OK
我是這樣做的
以上是我做western的一點小小經驗,若有錯誤觀念請指正~
謝謝:)
※ 編輯: tinapig 來自: 123.110.26.146 (04/12 01:21)