作者egoweaver (Hiko)
看板Biotech
標題[求救] Recombinant protein expression
時間Wed Apr 22 18:26:48 2009
小弟最近在做protein expression的實驗，用的vector是pET30a和pGEX4T-1
第一次養的時候因為在養1ml的時候太早養，怕它長過頭所以流程變成：
1.pick 1 colony(pET/pGEX in BL21) in selective LB, incubate at 37℃(4hr)
2.In 4℃ refrigerator for ~2hr
3.dilute 100ul in 100ml of selective LB, incubate at 37℃ (~2hr)
↑不知道為什麼長很慢
所以養比較久。
4.Induction(1M IPTG 100ul)
5.Incubate at 37℃ (13hr)
結果最後induction和no-induction跑SDS-Page的結果看不出來有什麼不同，感覺沒有成功
induction，學長建議我改25℃其他condition不變再養一次試試看。
第二次的流程和第一次一樣，除了1ml的菌液沒有進冰箱，然後induction後改成25℃養，
這次induction就有起來(雖然我覺得我太晚induction了，覺得時機很不好拿捏……)，不
過做出來的protein都是insoluble form。
我應該要怎麼改下次養的condition比較有機會做出soluble form的protein呢？
．在板上看到有人把溫度降到18℃在養，這樣子是要養比較久是嗎？
．學長建議我把養的時間縮短看看會不會不是全部的protein都進inclusion body。
．老師覺得把Medium換成M9有機會做出soluble form，但是老師說他覺得我不管怎麼試機
會都不大Orz
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順便問一下，菌液的英文怎麼講啊……
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◆ From: 140.112.244.194
推 kshsdeck:蛋白表現的很多可能性都要試了才知道,蠻碰運氣的 04/22 18:49
推 alaric:測一下OD. 在0.6-0.8時才加IPTG. IPTG可以放少些. 04/22 19:39
推 alaric:抓條件,養1ml expression看看... 04/22 19:42
→ egoweaver:之前原本有想養1ml 不過學長姊說他們經驗是等到養100ml 04/22 20:20
→ egoweaver:還是得再調condition，結果就變成很奢侈的直接養100ml了 04/22 20:21
→ egoweaver:直接把菌液拿去測OD嗎?可以用平常的cuvette不會汙染?覺 04/22 20:22
→ egoweaver:得怕怕的||| 對於沒做過的事orz 04/22 20:22
推 bluecsky:E.coli嗎? 100ml一點都不奢侈歐XD..在我待的lab 6L是基本 04/22 20:57
→ bluecsky:阿 不過你是測condition而已..可以在養少一點吧 04/22 20:57
→ egoweaver:對啊||| 不過我只是要做少量去immunization 所以100ml就 04/22 22:05
→ egoweaver:是正式養的量了……可以放6L的incubator感覺很酷XD 04/22 22:05
推 alaric:也只是取1ml去測個OD. 抓條件是必要的.. 04/24 20:38
推 wt1seven:IPTG可低到1 microM 或改用含GROEL系列的菌株 試renature 04/24 22:47