推 turtle24:我的protein接了MBP就insoluble了..XDD 04/25 15:17
推 egoweaver:謝謝！ 04/25 19:50
※ 引述《egoweaver (Hiko)》之銘言：
: 小弟最近在做protein expression的實驗，用的vector是pET30a和pGEX4T-1
: 第一次養的時候因為在養1ml的時候太早養，怕它長過頭所以流程變成：
: 1.pick 1 colony(pET/pGEX in BL21) in selective LB, incubate at 37℃(4hr)
: 2.In 4℃ refrigerator for ~2hr
: 3.dilute 100ul in 100ml of selective LB, incubate at 37℃ (~2hr)
: ↑不知道為什麼長很慢
: 所以養比較久。
: 4.Induction(1M IPTG 100ul)
: 5.Incubate at 37℃ (13hr)
: 結果最後induction和no-induction跑SDS-Page的結果看不出來有什麼不同，感覺沒有成功
: induction，學長建議我改25℃其他condition不變再養一次試試看。
: 第二次的流程和第一次一樣，除了1ml的菌液沒有進冰箱，然後induction後改成25℃養，
: 這次induction就有起來(雖然我覺得我太晚induction了，覺得時機很不好拿捏……)，不
: 過做出來的protein都是insoluble form。
: 我應該要怎麼改下次養的condition比較有機會做出soluble form的protein呢？
: ．在板上看到有人把溫度降到18℃在養，這樣子是要養比較久是嗎？
: ．學長建議我把養的時間縮短看看會不會不是全部的protein都進inclusion body。
: ．老師覺得把Medium換成M9有機會做出soluble form，但是老師說他覺得我不管怎麼試機
: 會都不大Orz
當兵當一段時間了 但應該還記得
首先單單看sds-page是不準的
應該用western blot比較看看
若是WB的結果你的soluble那部份有你的蛋白質的話
那的確可以改變其他條件增加溶解率(如改溫度、降IPTG濃度)
最差最差的情況，大不了養多一點來純化
如果沒有，那很抱歉 你改這些條件的影響恐怕不明顯
我覺得影響最大的是接MBP.....效果很棒
但缺點是MBP很大...
另外也能考慮用皮奇亞表現~~
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※ 編輯: aggaci 來自: 219.71.128.78 (04/25 14:29)
※ 編輯: aggaci 來自: 219.71.128.78 (04/25 14:30)