推 hurdle:不知道可不可以先用Trypsin 把Tissue弄成單一細胞再做~~ 05/13 04:28
推 Helene:是新鮮活體的話 試試看先用collagenase perfusion 05/14 15:28
請問有人有經驗從"animal tissue"萃取nuclear protein嗎?
之前我都是從cultured cells做protein fractionation，結果都還不錯
現在換處理tissue後用另一個protocol <--但是我做了都失敗
以前做細胞時破膜後都可以用顯微鏡觀察到群聚的核
而做組織就不行，亂七八糟的
以下是我從組織萃核蛋白的方式，請幫我看看可能哪裡有問題
1. 把組織切碎 (小鼠肝組織)
2. 加入0.25M sucrose buffer後用Teflon homogenizer破膜 (轉速1000/min，戳10次)
3. 過mesh (pore size 200uM)
4. 離心600g, 10 min -->取上清液為cytosolic fraction
5. 接下來是用uncontinuous gradient sucrose buffer 離心
但是我做到3後在顯微鏡下觀察細胞核就看不太到
第4步離心後還有pellte，到後面gradient sucrose 離心就沒pellet了
我取的組織量約100mg
cytosol fraction有拿去測濃度，很正常
不知道中間這幾步是哪裡要改善呢
或是有其他不錯的protocol呢?
(網路上查到幾乎都是kit，還是說真的換成kit好?! @_@)
謝謝!
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蘆葦作成的風笛啊
捉弄著森林中單獨行走的人呢
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