Re: [求救] 請問ligation後出現突變的問題

[lenti (啄木鳥)]

※ 引述《SugarSa (Ｍｒ.)》之銘言：
: 我的實驗是用從template當中P出我要的片段再接到vector中
: 但是好不容易接進去之後，挑colony、送定序卻發現insert錯了兩個點
: 由於之前有用同一個template P出序列正確的片段
: 所以可以排除是template問題
: 現在我的問題是
: 現在如果從同一個plate中，再挑新的colony，會有機會挑到對的嗎？
: 還是一定要重新P，ligation，整個重來呢？
: 謝謝

問題主要是在PCR, 你可能需要用好一點的taq.

或者, 在PCR mix中, 再外加 Mg2+, 也可以提高PCR 的正確率.

當然, 降低 cycle 數也是可以考慮的.

至於同一個plate是否可以再挑, 當然可以.

雖然有可能挑到正確的, 只是機會較小.

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◆ From: 140.112.125.66
推 SugarSa:因為我用的是phusion,理論上錯誤率應該很低才是
→ SugarSa:然後我跑30個cycle,不知道為啥會錯了兩個點
推 chvkimo:phusion就不是taq了,基本上應該有prove reading,你應該有
→ chvkimo:照說明書設定PCR條件吧~~ 也許在重做一次應該就成功了吧
→ chvkimo:錯誤機率應該沒那麼高
推 luwbino:你有排除定序錯誤了嗎?不然就多送幾個colony嚕