作者coconutt (人生就是挑戰挑戰)
看板Biotech
標題[求救] 有關western blot 問題 請大家幫幫忙
時間Sun Jul 5 21:38:18 2009
大家好 因為工作所以開始接觸western blot 大約快兩個月
之前只有在教科書紙上談兵
現在用的protocol是實驗室建立起來的 當初有看實驗室的人做過
但是大約做了兩個月的我 一直有幾個問題 搞不定 弄的自己心煩老師也不耐煩
想請各位高手指點一下問題到底出在哪邊？
1.首先在收蛋白質部分 我收的量每次都低於200ug？
先講我的方法: 我將"10 cm dish" "八成"滿且細胞不是很大的dish,去medium,
wash PBS,在去掉PBS,後加入1ml的PBS,刮下（有用顯微鏡確認都刮下）
離心5000rpm 5min,去PBS後依照pellet加入MENT+Protein inhibitor
cocktail(1000:10)大約都加50-100ul並打很散,而後放在冰上每十分
鐘又去強力衝pellet,共30分鐘,而後甚至放到-80度冷凍15分鐘在解凍
（現在我還加上sonicate 10分鐘 每十秒休息五秒然後13000rpm 30分鐘
吸上清液（有小心不吸到pellet)只是有時候液面好像有一層膜,那到底
是什麼東西？
之後就2ulsample protein+ 18ul ddw +480 ul Bio-rad protein assay
測吸光值每次R大約在0.975-0.995（每次都做standard)
但每次我的蛋白質量都低於200ug.....真的很想哭 每次做三次就沒了？
到底問題出在哪邊呢,實驗室每個人也是這樣做 他們都可以收到500ug以
上,請大家幫幫忙 謝謝
2.再者更嚴重的問題是,到目前為止 我的tubulin 總是不會等量 真的除了手殘外
沒有其他原因了嗎？到目前不下跑過20多遍的western blot,但每次的tubulin都不
equal,所以每次壓出來想看的蛋白都無法比較,讓老闆非常不滿.
我還是把我的作法講一下 請大家提點一下,其中有幾個小問題 也麻煩大家解答一下
我會算好50ug蛋白所需要的ul加入4xdye,補lysis buff都到40ul離心,夾防爆夾煮沸
10min,放冰上,再離心,然後加入well內,問題來了,明明我每個sample理論上應該都是
40ul但是每次在pillet入well時都不到40ul,我問我同事他們說裡應該都超過,但為什
麼我會不足？（我有確定並沒有加錯或是沒有加到）所以到底為什麼會不足呢？
之後跑80V 5%stacking gel理論上應該我的loading的sample應該此時都聚集一條線,
而後才會進入10%的下膠但是我發現我們家跑的都有拖很長（大約3/4個well長度),一直
到下膠跑到最後的1/4處才會慢慢壓成一條線？請問這是正常的嗎？是哪邊出了問題？
這會影響到我的結果嗎?
之後就用300mA轉3小時然後blocking 1hr,wash three times,加入一抗4度overnight
隔天wash three times, 二抗一小時,wash theree times again然後ECL顯影
然後心情就開始不好了......因為tubulin都不equal(因為我要壓的有在20-30kb
所以沒壓actin
很感謝你把這篇文章看到這邊,如果你有任何想法或是哪邊有問題,我會馬上再解釋清楚
也希望你覺得我哪邊可以怎麼做 也麻煩你解答一下...十分感激你
謝謝大家
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 123.205.33.179
推 ranilla:lysis br.加太少，會影響細胞lysis的程度，導致蛋白量少 07/05 22:22
→ ranilla:你需要比較一下，對於10cm dish,其他人加的量 07/05 22:22
推 ranilla:另外，打的太散，DNA沾黏的蛋白也會便多 07/05 22:25
→ ranilla:sample dye沾黏tip的情形很嚴重，本來就會減少一些 07/05 22:28
→ ranilla:300mA 3hr時間有點久，但如果你實驗室大家都麼做就沒差 07/05 22:31
→ ranilla:40ul是全加嗎？還是取10ul分四片跑？ 07/05 22:32
→ ranilla:若是分片加，每管的蒸發率可能造成tubulin不一致 07/05 22:34
→ ranilla:但不應該這麼大到影響定量，採用別的internal control? 07/05 22:35
→ ranilla:比如說，看不同處理neural分化程度時，不適合用actin 07/05 22:36
→ coconutt:我是每個處理50ug 所以弄成40ul到每個well 07/05 22:51
→ coconutt:如果要做兩片的話我是各別加入50ug到兩個eppendorff 07/05 22:53
→ coconutt:不好意思我有點不懂"DNA沾黏的蛋白"為何會影響蛋白質量？ 07/05 23:09
→ ranilla:不同管的細胞核被打破的程度不一，因為你文中有提到你有用 07/05 23:13
→ ranilla:sonication 07/05 23:13
→ ranilla:就像抽plasmid時< 07/05 23:14
→ ranilla:有時過份trypsinized的cell culture也會看到黏在一起的 07/05 23:17
→ ranilla:細胞，這樣離心時，那些細胞或蛋白就一起被離掉了 07/05 23:18
→ ranilla:plasmid那段為錯推文 07/05 23:18
推 tsubasawolfy:有蓋緊管口煮完後離心照理說應該體積不變吧? 07/05 23:21
→ wangba:sample protein 取的量有沒有可能太少 導致定量不準 07/06 03:19
→ coconutt:我同事是加2ulsample protein定量 他們的定量都是OK... 07/06 07:09
推 Seal13:離心5000rpm??? 通常離心細胞大概都2000rpm上下 07/06 16:13
→ Seal13:你的是什麼細胞呢? 07/06 16:14
推 xenosdk:樓上+1 離心細胞通常是500g 請確認你rpm換算過去沒超過500 07/07 11:54